Immunrespons og utfall etter aortaklaffkirurgi (mål) (Measure)

Eksperimentell design og metoder:

Innstilling:

Barts Heart Center er et spesialisthjertesenter med 255 sengeplasser hvor det utføres ca. 200 primære isolerte åpne aortaklafferstatningsprosedyrer per år. Det er nært knyttet både geografisk og akademisk til William Harvey Research Institute (WHRI), som utgjør en del av Queen Mary University, London (QMUL). Dette vil tillate laboratorieanalyse av alle innsamlede blodprøver innen 15 minutter om nødvendig. Barts Heart Center er en av de største hjerteenhetene i Europa, og et sentralt forskningsmål for QMUL/WHRI er å støtte hjerteforskning.

Prøveinnsamling og oppbevaring:

Etter skriftlig informert samtykke vil alle pasienter bli preoperativt risikoscoret ved hjelp av ASA, Euroscore 2 og konvensjonelt risikoscoret for utvikling av infeksjon på operasjonsstedet.

Blod (totalt 44 ml) vil bli tatt fra 150 aortaklaffepasienter umiddelbart før operasjonen (T0).

Blod (7 ml) vil bli samlet inn i et PAXgene-rør og lagret ved -80° for senere genetisk analyse. En koagulert prøve (7 ml) vil bli samlet i et standard SST-rør med gulltopp, la det koagulere og deretter sentrifugere i 10 minutter ved 1000 g, serumet separeres og lagres ved -80° for senere analyse av antistoffnivåer. I tillegg vil 30 ml blod bli tatt for studier av perifere blod mononukleære celler (PBMC), trukket inn i standard lilla topp EDTA rør (antikoagulant). Disse vil bli separert innen 3 timer etter innsamling ved Ficoll-Paque tetthetsgradientsentrifugering, hvor PBS-fortynnet blod forsiktig legges over Ficoll og brems av i en sentrifuge ved 400g i 30 minutter. PBMC-laget ekstraheres deretter og vaskes to ganger i PBS og lagres i 10 % dimetylsulfoksid-fryseløsning i flytende nitrogen slik at de kan tines, og batch-analyseres på et senere tidspunkt.

Prøveanalyse:

PBMC-er vil bli talt ved hjelp av et hemocytometer, deretter dyrket i RPMI og 10 % serum med enten LPS, α-toksin eller ustimulert i 24 timer, hvoretter de vil bli analysert umiddelbart som beskrevet nedenfor.

• Løselige mediatorer (plasma)

• Oppbevaring: Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) antikoagulert blod vil bli sentrifugert (1200 g, 10 minutter, 20 °C) og plasma lagret ved -80 °C innen 2 timer etter innsamling
• Analyse:

Cytokiner: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatory Panel 1 vil bli brukt for å kvantifisere IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 IL-8 og TNF-a. Platene vil bli lest ved hjelp av en MSD QuickPlex SQ 120 imager (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Antistoffer: Disse vil bli målt ved hjelp av ELISA-analyser mot stafylokokkantigener (α-toksin, teichoic acid) og kjernedeler av endotoksinmolekylet (EndoCAb).

• Helblods LPS/α-toksin Stimulert cytokinfrigjøring

  • Teknikk: Som tidligere beskrevet og validert i laboratoriet vårt, vil heparinisert blod stimuleres i 4 timer (37 °C, 250 rpm) med 1 ng/ml LPS innen 2 timer etter uttak. Etter inkubering vil prøvene sentrifugeres (1200 g, 10 minutter, 20 °C) og supernatanten lagres ved -80 °C.
  • Cytokinkvantifisering: I henhold til 'løselige mediatorer' vil MSD V-PLEX Proinflammatory Panel 1 bli brukt for å kvantifisere TNF-α (primært resultat som metrikk for immunkompetanse) og andre cytokiner. Cytokiner vil uttrykkes som en faktor av antall sirkulerende monocytter.

• Flowcytometrisk immunfenotyping og funksjonell vurdering av leukocytter

  • Flowcytometri: Alle prøver vil bli analysert på samme maskin (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Standardisering og sammenligning av utdata vil bli oppnådd ved bruk av konstante spenninger og kompensasjonsmatrise gjennom med daglig matching av verdier til en enkelt gruppe med Cytometri Setup and Tracking (CS&T) perler (BD). Leukocyttcelleoverflatefarging vil bli utført ved bruk av antistoffer som hovedsakelig leveres av BD. Farging, datafangst og lagring vil bli utført i henhold til en enkelt studiestandard operasjonsprosedyre. 5 paneler (opptil 14 farger) og to funksjonelle analyser vil bli utført på hvert tidspunkt. Data vil bli analysert i FlowJo versjon 10.5.
  • Overflatemarkørfarging:

Kvantifiserings- og kalibreringspanel: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, utført i et BD TruCount-rør for å muliggjøre opptelling av celleundersett Cellespesifikke paneler (inkluderer markører for underkategorisering og markører for immunkompetanse)

• Monocytt/myeloid: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Nøytrofil: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymfocytt: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR-uttrykk: Vil kvantifiseres på CD14+-monocytter ved bruk av BD QuantiBrite-perler.

  • Funksjonelle tiltak Fagocytose: Evnen til nøytrofiler og monocytter til å fagocytere opsoniserte FITC-merkede E.coli-bakterier vil bli kvantifisert via PhagoTest-analysen (BD) i henhold til produsentens instruksjoner Reaktivt oksygenutbrudd: Kvantitativ bestemmelse av leukocyttoksidativt utbrudd vil bli foretatt PhagoBurst-analysen (BD) som respons på umerket opsonisert E.coli, phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og det kjemotaktiske peptidet N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Pre-kirurgi prøve PBMCs som vil bli stimulert med LPS (type og konsentrasjon skal optimaliseres via doseresponskurve på friske frivillige) og α-toksin vil gjennomgå flowcytometri for å måle TLR4 og TLR5 overflateekspresjon, HLA-DR overflateekspresjon og kvantifisering av NF-kB ved bruk av passende antistoffer validert i litteraturen. Ved slutten av stimuleringen vil cellene bli høstet, og RNA ekstrahert for kvantitativ (q)PCR for å evaluere AID mRNA-ekspresjon. Selv om B-celler i PBMC-kulturene har blitt stimulert i nærvær av andre celletyper, først og fremst T-celler og monocytter-makrofager, er vårt endepunkt å måle en B-cellerespons, da AID utelukkende uttrykkes i B-celler.

Nok sunt frivillig blod er tilgjengelig slik at alle ovennevnte teknikker kan praktiseres og optimaliseres tilstrekkelig før pasientrekruttering.

Ytterligere prøvetakingstidspunkter vil være umiddelbart etter operasjon (T1), 24 timer etter operasjon (T2), utskrivning (T3) og 4 uker etter operasjon ved kirurgisk oppfølging (T4). Blodet som samles inn ved 4-ukers oppfølging etter operasjonen, vil bli analysert for IgG-antistoffanalyse mot EndoCAb, α-toksin og teichoinsyre. Dette vil muliggjøre et mål på klassesvitsjrekombinasjon. Som vil kunne refereres tilbake til graden av ekspresjon av AID mRNA.

Populasjonen av aortaklafferstatningspasienter vil bli fulgt opp for dødelighet og større sykelighet. De vil bli skåret i henhold til C-POMS (cardiac post-operative morbidity score), lengden på ITU-oppholdet og lengden på sykehusoppholdet. Pasienter vil bli overvåket for utvikling av infeksjon på operasjonsstedet (SSI) eller erverv av postoperativ sykehuservervet infeksjon (HAI). Oppfølging etter utskrivning for sårinfeksjon eller sammenbrudd vil fortsette i 12 måneder.

På det umiddelbart preoperative tidspunktet (T0), sammen med nåværende aksepterte mål for immunrespons, er det ment å utføre en nærpasienttest av immunrespons (LIT) ved bruk av en håndholdt kjemiluminescensenhet som er avhengig av leukocyttoksidativt utbrudd til en supramaksimal stimulus (Oxford Medistress). Dette er avhengig av analyse av responsen i en 10mcl frisk kapillærblodprøve.

Statistiske betraktninger:

Fra publiserte data fra sentre over hele verden er det kjent at en andel av pasientene utvikler en infeksjon, enten kirurgisk stedsinfeksjon (SSI) eller sykehuservervet infeksjon (HAI), etter aortaklaffkirurgi. Det er også kjent at disse pasientene tåler lengre opphold på sykehus etter operasjon.

Etterforskerne har vist at blant disse pasientene er det variasjon i nivåer av antistoffer mot ulike perioperative trusler, nemlig endotoksin og stafylokokker.

Etterforskerne har vist at hos pasienter som gjennomgår kirurgi og har lave nivåer av sirkulerende antistoff mot endotoksin og/eller stafylokokker er det en sammenheng med større sannsynlighet for å utvikle en infeksjon og lengre oppholdstid etter operasjonen. Etterforskerne anslår at infeksjonsraten varierer mellom 13,5 – 33 %.

Etterforskerne har tidligere antydet at assosiasjonen mellom antistoffnivå og utfall kan være en manifestasjon av en underliggende svekket evne hos enkelte individer til å montere en normal immunrespons på disse truslene.

Det er kjent at en del av individene har en unormal immunrespons. Dette er kanskje mest åpenbart sett i responsen på vaksinasjon der tidligere arbeid har vist mangel på immunrespons etter ulike vaksinasjonsprogrammer og vårt eget arbeid med EndoCAb-respons på monovalent tyfusvaksinasjon. Denne ikke/dårlige responsen i disse studiene ligger et sted mellom 10 og 40 %. Diagrammet illustrerer andelen ikke-respondere (dvs. dårlig immunrespons) hvis de er likt fordelt.