大動脈弁手術後の免疫応答性と転帰（測定） (Measure)

実験計画と方法:

設定:

Barts Heart Center は 255 床のスペシャリスト心臓センターで、年間約 200 件の主要な分離開放大動脈弁置換術が行われています。 ロンドンのクイーン メアリー大学 (QMUL) の一部であるウィリアム ハーベイ研究所 (WHRI) と地理的にも学術的にも密接に関連しています。 これにより、必要に応じて、採取したすべての血液サンプルを 15 分以内に検査室で分析できます。 Barts Heart Center はヨーロッパ最大の心臓病棟の 1 つであり、QMUL/WHRI の主な研究目的は心臓研究をサポートすることです。

サンプルの収集と保管:

書面によるインフォームド コンセントに続いて、すべての患者は、ASA、Euroscore 2 によって術前にリスク スコアが付けられ、手術部位感染の発症について従来どおりリスク スコアが付けられます。

手術直前（Ｔ０）に１５０人の大動脈弁置換患者から血液（合計４４ｍｌ）を採取する。

血液（7ml）をPAXgeneチューブに採取し、後の遺伝子解析のために-80°で保存します。 凝固したサンプル（7ml）を標準のゴールドトップSSTチューブに採取し、凝固させた後、1000gで10分間遠心分離し、血清を分離して、後の抗体レベルの分析のために-80°で保存します。 さらに、末梢血単核細胞 (PBMC) の研究のために 30 ml の血液を採取し、上部が紫色の標準的な EDTA チューブ (抗凝固剤) に抜き取ります。 これらは、Ficoll-Paque 密度勾配遠心分離によって収集後 3 時間以内に分離されます。これにより、PBS で希釈された血液が Ficoll の上に慎重に重ねられ、400g の遠心分離機で 30 分間スピン ブレーキがかけられます。 次に、PBMC 層を抽出し、PBS で 2 回洗浄し、液体窒素中の 10% ジメチル スルホキシド凍結溶液に保存して、後で解凍し、バッチ分析します。

サンプル分析:

血球計を使用して PBMC をカウントし、RPMI および 10% 血清で LPS、α-毒素を含むか、または無刺激で 24 時間培養した後、以下に詳述するように直ちに分析します。

• 可溶性メディエーター (血漿)

• 保存：エチレンジアミン四酢酸（EDTA、BD Biosciences Vacutainer、9mL）抗凝固処理された血液は遠心分離され（1200g、10分、20°C）、血漿は収集後2時間以内に-80°Cで保存されます
• 分析：

サイトカイン: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX 炎症誘発性パネル 1 を使用して、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6 を定量化します。 、IL-8、およびTNF-α。 プレートは、MSD QuickPlex SQ 120 イメージャー (Wiliam Harvey Institute、QMUL) を使用して読み取られます。

抗体: これらは、ブドウ球菌抗原 (α-毒素、テイコ酸) およびエンドトキシン分子のコア部分 (EndoCAb) に対する ELISA アッセイによって測定されます。

• 全血LPS/α-毒素によるサイトカイン放出の刺激

  • 技術: 以前に説明し、私たちの研究室で検証されているように、ヘパリン化血液は、採取後 2 時間以内に 1 ng/ml の LPS で 4 時間 (37°C、250 rpm) 刺激されます。 インキュベーション後、サンプルを遠心分離し（1200g、10分、20℃）、上清を-80℃で保存します。
  • サイトカインの定量化: 「可溶性メディエーター」に従って、MSD V-PLEX 炎症誘発性パネル 1 を使用して、TNF-α (免疫能力の測定基準としての主要な結果) およびその他のサイトカインを定量化します。 サイトカインは、循環単球数の係数として表されます。

• 白血球のフローサイトメトリーによる免疫表現型検査と機能評価

  • フローサイトメトリー: すべてのサンプルは、同じマシン (Becton Dickinson (BD) Fortessa、Rayne Building、UCL) で分析されます。 出力の標準化と比較は、Cytometry Setup and Tracking (CS&T) ビーズ (BD) の 1 つのバッチに値を毎日一致させることで、定電圧と補償マトリックスを採用することで達成されます。 白血球細胞表面染色は、主に BD が提供する抗体を使用して実施されます。 染色、データの取得、および保存は、単一の研究標準操作手順に従って実施されます。 5 パネル (最大 14 色) と 2 つの機能アッセイは、各時点で実行されます。 データは FlowJo バージョン 10.5 で分析されます。
  • 表面マーカー染色:

定量化およびキャリブレーションパネル: CD45、CD56、CD3、CD4、CD8、CD19、CD14、CD16、細胞サブセットの列挙を可能にするために BD TruCount チューブで実施 細胞特異的パネル (サブ分類のマーカーおよび免疫能力のマーカーを組み込む)

• 単球/骨髄: CD3、CD19、CD56、CD163、CD16、CD33、CD141、CD206、CD274、CD14、CD1c、CD11c、HLA-DR、CD80、CD123、CD83
• 好中球: CD3、CD19、CD56、HLA-DR、CD64、CD62L、CD11b、CD88、CD66b、CD14、CD11c、CD16、CD184、CD182

• リンパ球: CD19、CCR6、CD45RA、CD3、CD4、CD8、CXCR3、CD127、CD62L、CD25、CD56、CD27、CD279 HLA-DR 発現: BD QuantiBrite ビーズを使用して CD14+ 単球で定量化されます。

  • 機能的測定 食作用: 好中球および単球がオプソニン化した FITC 標識大腸菌を貪食する能力は、メーカーの指示に従って PhagoTest アッセイ (BD) を介して定量化されます。非標識オプソニン化大腸菌、ホルボール 12-ミリステート 13-アセテート (PMA)、および走化性ペプチド N-ホルミル-Met-Leu-Phe (fMLP) に応答する PhagoBurst アッセイ (BD)。

o LPS（健康なボランティアの用量反応曲線を介して最適化されるタイプと濃度）およびα毒素で刺激される手術前のサンプルPBMCは、TLR4およびTLR5の表面発現、HLA-DRの表面発現を測定するためにフローサイトメトリーを受けます。文献で検証された適切な抗体を使用した NF-kB の定量化。 刺激の最後に、細胞を採取し、RNA を抽出して定量的 (q)PCR を行い、AID mRNA 発現を評価します。 PBMC 培養中の B 細胞は、他の細胞タイプ、主に T 細胞および単球マクロファージの存在下で刺激されていますが、AID は B 細胞でのみ発現するため、エンドポイントは B 細胞応答を測定することです。

十分な量の健康な志願者の血液が利用可能であるため、患者募集の前に上記のすべての技術を適切に実践し、最適化することができます。

さらにサンプリングのタイムポイントは、手術後すぐ (T1)、手術後 24 時間 (T2)、退院時 (T3)、手術後 4 週間 (T4) になります。 手術後 4 週間のフォローアップで採取した血液を、EndoCAb、α-毒素、およびテイコ酸に対する IgG 抗体アッセイについてアッセイします。 これにより、クラス スイッチ組換えの測定が可能になります。 これは、AID mRNAの発現の程度にまでさかのぼることができます。

大動脈弁置換患者の人口は、死亡率と主要な罹患率について追跡されます。 それらは、C-POMS (心臓術後罹患率スコア)、ITU 滞在期間、および入院期間に従って採点されます。 患者は、手術部位感染（SSI）の発症または術後の院内感染（HAI）の獲得について監視されます。 退院後の創傷感染または故障のフォローアップは 12 か月間継続されます。

術前の時点 (T0) で、現在受け入れられている免疫応答性の測定に加えて、超最大刺激への白血球酸化バースト (オックスフォードメディストレス）。 これは、10mcl の新鮮な毛細血管血サンプルの応答の分析に依存しています。

統計上の考慮事項:

世界中のセンターから公開されたデータから、大動脈弁手術後に手術部位感染 (SSI) または院内感染 (HAI) のいずれかの感染症を発症する患者の割合が知られています。 また、これらの患者は手術後の入院期間が長くなることが知られています。

研究者は、これらの患者の間で、さまざまな周術期の脅威、すなわちエンドトキシンとブドウ球菌に対する抗体のレベルにばらつきがあることを実証しました。

研究者らは、手術を受けており、エンドトキシンおよび/またはブドウ球菌に対する循環抗体のレベルが低い患者では、感染症を発症する可能性が高く、術後の入院期間が長いことと関連があることを実証しました. 研究者は、感染率は 13.5 ～ 33% の間で変動すると推定しています。

研究者らは以前、抗体レベルと転帰との関連は、これらの脅威に対する正常な免疫応答を開始する一部の個人の根底にある能力障害の現れである可能性があることを示唆しています.

一定割合の個人が異常な免疫反応を示すことが知られています。 これはおそらく、以前の研究でさまざまなワクチン接種プログラム後の免疫応答性の欠如が実証されているワクチン接種への反応と、一価腸チフスワクチン接種に対する EndoCAb の反応に関する私たち自身の研究で最も明白に見られます。 これらの研究におけるこの非反応性/反応性不良は、10% から 40% の間のどこかにあります。 この図は、非応答者 (つまり、免疫応答が低い) が均等に分布している場合の割合を示しています。