Reattività immunitaria ed esito dopo intervento chirurgico alla valvola aortica (misura) (Measure)

Disegno sperimentale e metodi:

Collocamento:

Il Barts Heart Center è un centro cardiaco specialistico con 255 posti letto in cui vengono eseguite circa 200 procedure primarie di sostituzione isolata della valvola aortica aperta all'anno. È strettamente associato sia geograficamente che accademicamente al William Harvey Research Institute (WHRI), che fa parte della Queen Mary University, London (QMUL). Ciò consentirà l'analisi di laboratorio di tutti i campioni di sangue raccolti entro 15 minuti, se necessario. Il Barts Heart Center è una delle più grandi unità cardiache in Europa e un obiettivo di ricerca chiave di QMUL/WHRI è sostenere la ricerca cardiaca.

Raccolta e conservazione dei campioni:

A seguito del consenso informato scritto, a tutti i pazienti verrà valutato il rischio preoperatorio mediante ASA, Euroscore 2 e convenzionalmente valutato il rischio per lo sviluppo di infezione del sito chirurgico.

Il sangue (44 ml in totale) verrà prelevato da 150 pazienti con sostituzione della valvola aortica immediatamente prima dell'intervento chirurgico (T0).

Il sangue (7ml) sarà raccolto in una provetta PAXgene e conservato a -80° per successive analisi genetiche. Un campione coagulato (7 ml) verrà raccolto in una provetta SST standard con tappo in oro, lasciato coagulare quindi centrifugato per 10 minuti a 1000 g, il siero separato e conservato a -80° per la successiva analisi dei livelli di anticorpi. Inoltre, verranno prelevati 30 ml di sangue per lo studio delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), aspirati in provette EDTA standard con tappo viola (anticoagulante). Questi saranno separati entro 3 ore dalla raccolta mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Paque, per cui il sangue diluito in PBS viene accuratamente stratificato su Ficoll e centrifugato in una centrifuga a 400 g per 30 minuti. Lo strato di PBMC viene quindi estratto e lavato due volte in PBS e conservato in una soluzione di congelamento di dimetilsolfossido al 10% in azoto liquido in modo che possano essere scongelati e analizzati in batch in un secondo momento.

Analisi del campione:

Le PBMC verranno contate utilizzando un emocitometro, quindi coltivate in RPMI e siero al 10% con LPS, α-tossina o non stimolate per 24 ore, dopodiché verranno analizzate immediatamente come descritto di seguito.

• Mediatori solubili (plasma)

• Conservazione: il sangue anticoagulato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) verrà centrifugato (1200 g, 10 minuti, 20 ° C) e il plasma conservato a -80 ° C entro 2 ore dalla raccolta
• Analisi:

Citochine: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinfiammatori Panel 1 sarà impiegato per quantificare IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-8 e TNF-α. Le lastre saranno lette utilizzando un imager MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Anticorpi: questi saranno misurati mediante saggi ELISA contro antigeni stafilococcici (α-tossina, acido teicoico) e frazioni centrali della molecola di endotossina (EndoCAb).

• Rilascio di citochine stimolato da LPS/α-tossina nel sangue intero

  • Tecnica: Come precedentemente descritto e validato nel nostro laboratorio, il sangue eparinizzato sarà stimolato per 4 ore (37°C, 250rpm) con 1ng/ml di LPS entro 2 ore dal prelievo. Dopo l'incubazione, i campioni saranno centrifugati (1200g, 10min, 20°C) e il surnatante conservato a -80°C.
  • Quantificazione delle citochine: come da "mediatori solubili", il pannello proinfiammatorio MSD V-PLEX 1 sarà impiegato per quantificare il TNF-α (esito primario come metrica della competenza immunitaria) e altre citochine. Le citochine saranno espresse come fattore del numero di monociti circolanti.

• Immunofenotipizzazione citometrica a flusso e valutazione funzionale dei leucociti

  • Citometria a flusso: tutti i campioni saranno analizzati sulla stessa macchina (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). La standardizzazione e il confronto dell'output saranno raggiunti mediante l'impiego di tensioni costanti e matrice di compensazione per tutto il tempo con l'abbinamento giornaliero dei valori a un singolo lotto di microsfere (CS&T) Cytometry Setup and Tracking (BD). La colorazione della superficie cellulare dei leucociti sarà condotta utilizzando anticorpi forniti principalmente da BD. La colorazione, l'acquisizione e l'archiviazione dei dati saranno condotti secondo una procedura operativa standard di un singolo studio. Verranno eseguiti 5 pannelli (fino a 14 colori) e due saggi funzionali in ciascun punto temporale. I dati saranno analizzati in FlowJo versione 10.5.
  • Marcatore di superficie colorazione:

Pannello di quantificazione e calibrazione: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, eseguito in una provetta BD TruCount per consentire l'enumerazione di sottogruppi cellulari Pannelli specifici per cellule (che incorporano marcatori di sottocategorizzazione e marcatori di competenza immunitaria)

• Monociti/mieloidi: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofilo: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Linfociti: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 Espressione HLA-DR: sarà quantificata su monociti CD14+ utilizzando microsfere BD QuantiBrite.

  • Misure funzionali Fagocitosi: la capacità dei neutrofili e dei monociti di fagocitare i batteri E.coli opsonizzati marcati con FITC sarà quantificata tramite il test PhagoTest (BD) secondo le istruzioni del produttore "Burst" di ossigeno reattivo: la determinazione quantitativa del burst ossidativo dei leucociti sarà effettuata utilizzando il test PhagoBurst (BD) in risposta a E.coli opsonizzato non marcato, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e il peptide chemiotattico N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP).

o I PBMC del campione pre-operatorio che saranno stimolati con LPS (tipo e concentrazione da ottimizzare tramite curva dose-risposta su volontari sani) e α-tossina saranno sottoposti a citometria a flusso per misurare l'espressione di superficie di TLR4 e TLR5, l'espressione di superficie di HLA-DR e quantificazione di NF-kB mediante opportuni anticorpi validati in letteratura. Al termine della stimolazione, le cellule saranno raccolte e l'RNA estratto per la (q)PCR quantitativa per valutare l'espressione dell'mRNA dell'AID. Sebbene le cellule B nelle colture PBMC siano state stimolate in presenza di altri tipi di cellule, principalmente cellule T e monociti-macrofagi, il nostro obiettivo è misurare una risposta delle cellule B, poiché l'AID è espresso esclusivamente nelle cellule B.

È disponibile abbastanza sangue di volontari sani in modo che tutte le tecniche di cui sopra possano essere adeguatamente praticate e ottimizzate prima del reclutamento dei pazienti.

Ulteriori tempi di campionamento saranno immediatamente post-operatori (T1), 24 ore post-operatorie (T2), dimissione (T3) e 4 settimane post-operatorie al follow-up chirurgico (T4). Il sangue raccolto al follow-up post-operatorio di 4 settimane sarà analizzato per il dosaggio degli anticorpi IgG contro EndoCAb, α-tossina e acido teicoico. Ciò consentirà una misura della ricombinazione del cambio di classe. Che sarà riconducibile al grado di espressione dell'mRNA dell'AID.

La popolazione di pazienti sottoposti a sostituzione della valvola aortica sarà seguita per la mortalità e la morbilità maggiore. Saranno valutati in base a C-POMS (punteggio di morbilità post-operatoria cardiaca), durata della degenza in ITU e durata della degenza ospedaliera. I pazienti saranno monitorati per lo sviluppo di infezione del sito chirurgico (SSI) o l'acquisizione di infezione acquisita in ospedale postoperatoria (HAI). Il follow-up post-dimissione per infezione o rottura della ferita continuerà per 12 mesi.

Al punto temporale immediatamente preoperatorio (T0), insieme alle misure attualmente accettate di risposta immunitaria, si intende eseguire un test di risposta immunitaria (LIT) presso il paziente utilizzando un dispositivo portatile a chemiluminescenza che si basa su un burst ossidativo dei leucociti a uno stimolo sovramassimale (Oxford Medistress). Questo si basa sull'analisi della risposta in un campione di sangue capillare fresco da 10 mcl.

Considerazioni statistiche:

Dai dati pubblicati dai centri di tutto il mondo è noto che una percentuale di pazienti sviluppa un'infezione, infezione del sito chirurgico (SSI) o infezione acquisita in ospedale (HAI), a seguito di un intervento chirurgico alla valvola aortica. È anche noto che questi pazienti sopportano una degenza ospedaliera più lunga dopo l'intervento chirurgico.

I ricercatori hanno dimostrato che tra questi pazienti vi è variabilità nei livelli di anticorpi contro varie minacce perioperatorie, vale a dire endotossina e stafilococco.

I ricercatori hanno dimostrato che nei pazienti sottoposti a intervento chirurgico e con bassi livelli di anticorpi circolanti contro l'endotossina e/o lo stafilococco esiste un'associazione con una maggiore probabilità di sviluppare un'infezione e una maggiore durata della degenza post-operatoria. Gli investigatori stimano che il tasso di infezione varia tra il 13,5 e il 33%.

I ricercatori hanno precedentemente suggerito che l'associazione tra il livello di anticorpi e l'esito potrebbe essere la manifestazione di una sottostante capacità compromessa in alcuni individui di montare una normale risposta immunitaria a queste minacce.

È noto che una percentuale di individui ha una risposta immunitaria anomala. Questo è forse più evidente nella risposta alla vaccinazione, dove il lavoro precedente ha dimostrato la mancanza di risposta immunitaria a seguito di vari programmi di vaccinazione e il nostro lavoro sulla risposta EndoCAb alla vaccinazione contro il tifo monovalente. Questa non/scarsa reattività in questi studi è compresa tra il 10 e il 40%. Il diagramma illustra la proporzione di non-responder (cioè scarsa risposta immunitaria) se sono equamente distribuiti.