대동맥 판막 수술 후 면역 반응 및 결과(측정) (Measure)

실험 설계 및 방법:

환경:

Barts 심장 센터는 255개의 병상을 갖춘 전문 심장 센터로 연간 약 200회의 일차 격리 개방 대동맥 판막 교체 절차가 수행됩니다. 런던의 Queen Mary University(QMUL)의 일부를 구성하는 William Harvey Research Institute(WHRI)와 지리적으로나 학술적으로 밀접하게 연결되어 있습니다. 이렇게 하면 필요한 경우 15분 이내에 수집된 모든 혈액 샘플의 실험실 분석이 가능합니다. Barts 심장 센터는 유럽에서 가장 큰 심장 장치 중 하나이며 QMUL/WHRI의 주요 연구 목표는 심장 연구를 지원하는 것입니다.

샘플 수집 및 보관:

서면 동의서에 따라 모든 환자는 ASA, Euroscore 2를 통해 수술 전 위험 점수를 매기고 수술 부위 감염의 진행에 대해 전통적으로 위험 점수를 매깁니다.

수술 직전(T0) 150명의 대동맥 판막 교체 환자로부터 혈액(총 44ml)을 채취합니다.

혈액(7ml)을 PAXgene 튜브에 수집하여 나중에 유전자 분석을 위해 -80°에 보관합니다. 응고된 샘플(7ml)을 표준 골드 탑 SST 튜브에 수집하고 응고되도록 방치한 다음 1000g에서 10분 동안 원심분리하고 혈청을 분리하여 나중에 항체 수준 분석을 위해 -80°에서 보관합니다. 또한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 연구를 위해 30ml의 혈액을 채취하여 표준 보라색 상단 EDTA 튜브(항응고제)에 채웁니다. 이들은 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리에 의해 수집 후 3시간 이내에 분리될 것입니다. 여기서 PBS로 희석된 혈액은 조심스럽게 Ficoll 위에 층을 이루고 원심분리기에서 400g으로 30분 동안 회전 제동을 겁니다. 그런 다음 PBMC 층을 추출하고 PBS에서 두 번 세척하고 액체 질소에서 10% dimethyl sulfoxide 동결 용액에 저장하여 해동할 수 있도록 하고 나중에 일괄 분석합니다.

샘플 분석:

PBMC는 혈구계수기를 사용하여 계수한 다음 RPMI 및 10% 혈청에서 LPS, α-독소 또는 무자극 상태로 24시간 동안 배양한 후 아래에 설명된 대로 즉시 분석합니다.

• 용해 매개체(플라즈마)

• 보관: Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9mL) 항응고 혈액은 원심분리(1200g, 10분, 20°C)하고 혈장은 수집 후 2시간 이내에 -80°C에서 보관합니다.
• 분석:

사이토카인: Meso Scale Discovery(MSD) V-PLEX Proinflammatory Panel 1은 IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6을 정량화하는 데 사용됩니다. , IL-8 및 TNF-α. MSD QuickPlex SQ 120 이미저(Wiliam Harvey Institute, QMUL)를 사용하여 플레이트를 판독합니다.

항체: 이들은 포도상구균 항원(α-독소, 테이코산) 및 내독소 분자(EndoCAb)의 코어 모이어티에 대한 ELISA 분석을 통해 측정됩니다.

• 전혈 LPS/α-독소 자극 시토카인 방출

  • 기술: 이전에 설명하고 실험실에서 검증한 바와 같이, 헤파린화된 혈액은 채취 2시간 이내에 1ng/ml LPS로 4시간(37°C, 250rpm) 동안 자극됩니다. 배양 후 샘플을 원심분리(1200g, 10분, 20°C)하고 상청액을 -80°C에 보관합니다.
  • 사이토카인 정량화: '가용성 매개체'에 따라 MSD V-PLEX 염증 유발 패널 1을 사용하여 TNF-α(면역 능력 측정 기준으로서의 주요 결과) 및 기타 사이토카인을 정량화합니다. 사이토카인은 순환하는 단핵구 수의 계수로 표현됩니다.

• 백혈구의 유세포 분석 면역 표현형 및 기능 평가

  • 유세포분석: 모든 샘플은 동일한 기계(Becton Dickinson(BD) Fortessa, Rayne Building, UCL)에서 분석됩니다. 출력의 표준화 및 비교는 세포계측 설정 및 추적(CS&T) 비드(BD)의 단일 배치에 대한 값의 일일 일치와 함께 전체에 걸쳐 일정한 전압 및 보상 매트릭스의 사용을 통해 달성됩니다. 백혈구 세포 표면 염색은 주로 BD에서 제공하는 항체를 사용하여 수행됩니다. 염색, 데이터 캡처 및 저장은 단일 연구 표준 운영 절차에 따라 수행됩니다. 5개의 패널(최대 14색)과 2개의 기능 분석이 각 시점에서 수행됩니다. 데이터는 FlowJo 버전 10.5에서 분석됩니다.
  • 표면 마커 염색:

정량화 및 보정 패널: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, BD TruCount 튜브에서 수행하여 세포 하위 집합을 열거할 수 있습니다. 세포 특정 패널(하위 범주화 마커 및 면역 능력 마커 통합)

• 단핵구/골수: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• 호중구: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• 림프구: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR 발현: BD QuantiBrite 비드를 사용하여 CD14+ 단핵구에서 정량화됩니다.

  • 기능 측정 식균작용: 호중구 및 단핵구가 옵소닌화된 FITC 표지 대장균 박테리아를 식균하는 능력은 제조업체의 지침에 따라 PhagoTest 분석(BD)을 통해 정량화됩니다. 반응성 산소 '폭발': 백혈구 산화 폭발의 정량적 결정은 표지되지 않은 옵소닌화된 대장균, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 화학주성 펩티드 N-포르밀-Met-Leu-Phe(fMLP)에 대한 파고버스트 분석(BD).

o LPS(건강한 지원자에 대한 용량 반응 곡선을 통해 최적화될 유형 및 농도) 및 α-독소로 자극될 수술 전 샘플 PBMC는 TLR4 및 TLR5 표면 발현, HLA-DR 표면 발현 및 문헌에서 검증된 적절한 항체를 사용한 NF-kB의 정량화. 자극이 끝나면 세포를 수확하고 정량적(q)PCR을 위해 RNA를 추출하여 AID mRNA 발현을 평가합니다. PBMC 배양의 B 세포가 다른 세포 유형, 주로 T 세포 및 단핵구-대식세포의 존재 하에서 자극되었지만 AID는 B 세포에서만 독점적으로 발현되기 때문에 우리의 종점은 B 세포 반응을 측정하는 것입니다.

환자를 모집하기 전에 위의 모든 기술을 적절하게 실행하고 최적화할 수 있도록 충분한 건강한 지원자 혈액을 사용할 수 있습니다.

추가 샘플링 시점은 수술 직후(T1), 수술 후 24시간(T2), 퇴원(T3) 및 수술 후 4주(T4)입니다. 수술 4주 후 후속 조치에서 수집된 혈액은 EndoCAb, α-독소 및 테이코산에 대한 IgG 항체 분석을 위해 분석됩니다. 이것은 클래스 스위치 재결합의 척도를 가능하게 할 것이다. 이는 AID mRNA의 발현 정도를 다시 참조할 수 있습니다.

대동맥 판막 교체 환자 집단은 사망률과 주요 이환율에 대해 후속 조치를 취할 것입니다. C-POMS(심장 수술 후 이환율 점수), ITU 체류 기간 및 입원 기간에 따라 점수가 매겨집니다. 수술 부위 감염(SSI) 발생 또는 수술 후 병원 획득 감염(HAI) 획득에 대해 환자를 모니터링합니다. 상처 감염 또는 손상에 대한 퇴원 후 후속 조치는 12개월 동안 계속됩니다.

수술 직전 시점(T0)에서 현재 허용되는 면역 반응성 측정과 함께 백혈구 산화 버스트에 의존하는 휴대용 화학발광 장치를 사용하여 면역 반응성(LIT)에 대한 가까운 환자 테스트를 수행하기 위한 것입니다(Oxford 메디스트레스). 이것은 10mcl의 신선한 모세혈관 혈액 샘플의 반응 분석에 의존합니다.

통계적 고려 사항:

전 세계 센터에서 발표된 데이터에서 대동맥 판막 수술 후 환자의 비율이 수술 부위 감염(SSI) 또는 병원 획득 감염(HAI)으로 발전하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 이러한 환자들은 수술 후 입원 기간이 더 긴 것으로 알려져 있습니다.

연구자들은 이 환자들 사이에서 다양한 수술 전후 위협, 즉 내독소 및 포도상구균에 대한 항체 수준에 가변성이 있음을 입증했습니다.

연구자들은 수술을 받고 있고 내독소 및/또는 포도상구균에 대한 순환 항체 수치가 낮은 환자에서 감염이 발생할 가능성이 더 높고 수술 후 체류 기간이 더 긴 연관성이 있음을 입증했습니다. 조사관은 감염률이 13.5~33% 사이라고 추정합니다.

연구자들은 이전에 항체 수준과 결과 사이의 연관성이 이러한 위협에 대해 정상적인 면역 반응을 일으키는 일부 개인의 근본적인 손상된 능력의 징후일 수 있다고 제안했습니다.

개인의 일부가 비정상적인 면역 반응을 보이는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 아마도 이전 작업에서 다양한 예방 접종 프로그램에 따른 면역 반응의 부족과 1가 장티푸스 예방 접종에 대한 EndoCAb 반응에 대한 자체 연구에서 입증된 예방 접종에 대한 반응에서 가장 분명하게 볼 수 있습니다. 이러한 연구에서 이러한 비/불량 반응성은 10~40% 사이에 있습니다. 다이어그램은 비반응자(즉, 면역 반응이 좋지 않음)가 균등하게 분포되어 있는 경우의 비율을 보여줍니다.