Imunitní reakce a výsledek po operaci aortální chlopně (měření) (Measure)

Experimentální design a metody:

Nastavení:

Barts Heart Center je specializované kardiologické centrum s 255 lůžky, kde se ročně provádí přibližně 200 primárních izolovaných operací náhrady otevřené aortální chlopně. Je úzce spojena jak geograficky, tak akademicky s William Harvey Research Institute (WHRI), který je součástí Queen Mary University v Londýně (QMUL). To v případě potřeby umožní laboratorní analýzu všech odebraných vzorků krve do 15 minut. Barts Heart Center je jednou z největších srdečních jednotek v Evropě a klíčovým výzkumným cílem QMUL/WHRI je podpora srdečního výzkumu.

Sběr a skladování vzorků:

Po písemném informovaném souhlasu bude všem pacientům předoperačně hodnoceno riziko pomocí ASA, Euroscore 2 a konvenčně hodnoceno riziko rozvoje infekce v místě operace.

Krev (celkem 44 ml) bude odebrána 150 pacientům s náhradou aortální chlopně bezprostředně před operací (T0).

Krev (7 ml) bude odebrána do zkumavky PAXgene a uložena při -80° pro pozdější genetickou analýzu. Sražený vzorek (7 ml) se odebere do standardní zkumavky SST se zlatým uzávěrem, nechá se srazit a poté se centrifuguje 10 minut při 1000 g, sérum se oddělí a uloží při -80 °C pro pozdější analýzu hladin protilátek. Kromě toho bude odebráno 30 ml krve pro studium mononukleárních buněk periferní krve (PBMC), odebraných do standardních EDTA zkumavek s fialovým uzávěrem (antikoagulant). Ty budou odděleny do 3 hodin od odběru centrifugací s hustotním gradientem Ficoll-Paque, přičemž PBS zředěná krev se opatrně navrství na Ficoll a odstředí se odstředí v odstředivce při 400 g po dobu 30 minut. Vrstva PBMC se poté extrahuje a promyje dvakrát v PBS a skladuje v 10% dimethylsulfoxidovém mrazícím roztoku v kapalném dusíku, aby mohly být rozmraženy a později analyzovány vsádkou.

Vzorová analýza:

PBMC budou počítány pomocí hemocytometru, poté kultivovány v RPMI a 10% séru buď s LPS, a-toxinem nebo nestimulované po dobu 24 hodin, poté budou okamžitě analyzovány, jak je podrobně popsáno níže.

• Rozpustné mediátory (plazma)

• Skladování: Krev antikoagulovaná s kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) bude odstředěna (1200 g, 10 minut, 20 °C) a plazma uložena při -80 °C do 2 hodin od odběru
• Analýza:

Cytokiny: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Prozánětlivý panel 1 bude použit ke kvantifikaci IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 IL-8 a TNF-a. Destičky se odečítají pomocí zobrazovače MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Protilátky: Tyto budou měřeny pomocí testů ELISA proti stafylokokovým antigenům (α-toxin, kyselina teichoová) a jádrovým skupinám molekuly endotoxinu (EndoCAb).

• Plná krev LPS/α-toxin stimulované uvolňování cytokinů

  • Technika: Jak již bylo popsáno a ověřeno v naší laboratoři, heparinizovaná krev bude stimulována po dobu 4 hodin (37 °C, 250 ot./min) s 1 ng/ml LPS během 2 hodin od odběru. Po inkubaci se vzorky odstředí (1200 g, 10 minut, 20 °C) a supernatant se uloží při -80 °C.
  • Kvantifikace cytokinů: Podle „solubilních mediátorů“ MSD V-PLEX Prozánětlivý panel 1 bude použit ke kvantifikaci TNF-α (primární výsledek jako metrika imunitní kompetence) a dalších cytokinů. Cytokiny budou vyjádřeny jako faktor počtu cirkulujících monocytů.

• Průtoková cytometrická imunofenotypizace a funkční hodnocení leukocytů

  • Průtoková cytometrie: Všechny vzorky budou analyzovány na stejném přístroji (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Standardizace a porovnávání výstupu bude dosaženo využitím konstantních napětí a kompenzační matice po celou dobu s denním přizpůsobením hodnot jedné dávce kuliček Cytometry Setup and Tracking (CS&T) (BD). Barvení buněčného povrchu leukocytů bude prováděno s použitím protilátek dodávaných hlavně BD. Barvení, sběr dat a uchovávání budou prováděny v souladu s jednotným standardním operačním postupem studie. V každém časovém bodě bude provedeno 5 panelů (až 14 barev) a dva funkční testy. Data budou analyzována ve FlowJo verze 10.5.
  • Barvení povrchových značek:

Panel kvantifikace a kalibrace: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, prováděné ve zkumavce BD TruCount, aby bylo možné vypočítat podskupiny buněk Panely specifické pro buňky (zahrnující markery subkategorizace a markery imunitní kompetence)

• Monocyty/myeloidní: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofil: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymfocyty: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR exprese: Bude kvantifikována na CD14+ monocytech pomocí kuliček BD QuantiBrite.

  • Funkční opatření Fagocytóza: Schopnost neutrofilů a monocytů fagocytovat opsonizované bakterie E.coli značené FITC bude kvantifikována pomocí testu PhagoTest (BD) podle pokynů výrobce Reaktivní kyslíkový „burst“: Kvantitativní stanovení oxidativního vzplanutí leukocytů bude provedeno pomocí test PhagoBurst (BD) v reakci na neznačené opsonizované E. coli, forbol 12-myristát 13-acetát (PMA) a chemotaktický peptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Vzorek PBMC před chirurgickým zákrokem, který bude stimulován LPS (typ a koncentrace budou optimalizovány pomocí křivky závislosti odpovědi na dávce na zdravých dobrovolnících) a a-toxinu, podstoupí průtokovou cytometrii k měření povrchové exprese TLR4 a TLR5, povrchové exprese HLA-DR a kvantifikace NF-kB pomocí vhodných protilátek ověřených v literatuře. Na konci stimulace budou buňky sklizeny a RNA extrahována pro kvantitativní (q)PCR pro vyhodnocení exprese AID mRNA. Ačkoli B buňky v kulturách PBMC byly stimulovány v přítomnosti jiných typů buněk, primárně T buněk a monocytů-makrofágů, naším cílem je měřit odpověď B buněk, protože AID je exprimována výhradně v B buňkách.

K dispozici je dostatek zdravé krve dobrovolníků, takže všechny výše uvedené techniky mohou být přiměřeně procvičovány a optimalizovány před náborem pacientů.

Další časové body odběru budou bezprostředně po operaci (T1), 24 hodin po operaci (T2), propuštění (T3) a 4 týdny po operaci při chirurgickém sledování (T4). Krev odebraná 4 týdny po chirurgickém sledování bude testována na stanovení IgG protilátek proti EndoCAb, a-toxinu a teichoové kyselině. To umožní míru rekombinace přepínače tříd. Což bude zpětně odkazovatelné na stupeň exprese AID mRNA.

Populace pacientů s náhradou aortální chlopně bude sledována z hlediska mortality a velké morbidity. Budou hodnoceni podle C-POMS (skóre srdeční pooperační morbidity), délky pobytu ITU a délky hospitalizace. U pacientů bude sledován vývoj infekce v místě chirurgického zákroku (SSI) nebo získání pooperační infekce získané v nemocnici (HAI). Sledování infekce nebo poruchy rány po propuštění bude pokračovat po dobu 12 měsíců.

V bezprostředně předoperačním časovém bodě (T0) je vedle aktuálně akceptovaných měření imunitní reakce zamýšleno provést test imunitní reakce u pacienta (LIT) pomocí ručního chemiluminiscenčního zařízení, které se opírá o oxidativní vzplanutí leukocytů na supramaximální stimul (Oxford Medistress). To závisí na analýze odezvy v 10 mcl čerstvého vzorku kapilární krve.

Statistická hlediska:

Z publikovaných údajů z center po celém světě je známo, že u části pacientů se po operaci aortální chlopně rozvine infekce, buď infekce v místě chirurgického zákroku (SSI) nebo infekce získaná v nemocnici (HAI). Je také známo, že tito pacienti po operaci snášejí delší pobyt v nemocnici.

Výzkumníci prokázali, že u těchto pacientů existuje variabilita v hladinách protilátek proti různým perioperačním hrozbám, jmenovitě endotoxinu a stafylokoku.

Výzkumníci prokázali, že u pacientů, kteří podstupují operaci a mají nízké hladiny cirkulujících protilátek proti endotoxinu a/nebo stafylokoku, existuje souvislost s větší pravděpodobností rozvoje infekce a delší pooperační dobou. Vyšetřovatelé odhadují, že míra infekce kolísá mezi 13,5 – 33 %.

Výzkumníci již dříve navrhli, že souvislost mezi hladinou protilátek a výsledkem může být projevem základní narušené schopnosti některých jedinců vyvolat normální imunitní odpověď na tyto hrozby.

Je známo, že část jedinců má abnormální imunitní odpověď. Nejzřetelněji je to patrné v reakci na očkování, kde předchozí práce prokázaly nedostatek imunitní reakce po různých očkovacích programech a naší vlastní práci na reakci EndoCAb na monovalentní očkování proti tyfu. Tato ne/špatná odezva v těchto studiích leží někde mezi 10 a 40 %. Diagram ilustruje podíl nereagujících (tj. špatná imunitní reakce), pokud jsou rovnoměrně rozmístěni.