Responsividade imunológica e resultado após cirurgia da válvula aórtica (medida) (Measure)

Desenho experimental e métodos:

Configuração:

O Barts Heart Center é um centro cardíaco especializado com 255 leitos, onde são realizados aproximadamente 200 procedimentos primários isolados de substituição da válvula aórtica aberta por ano. Está intimamente associado geograficamente e academicamente ao William Harvey Research Institute (WHRI), que faz parte da Queen Mary University, Londres (QMUL). Isso permitirá a análise laboratorial de todas as amostras de sangue coletadas em 15 minutos, se necessário. O Barts Heart Center é uma das maiores unidades cardíacas da Europa e um dos principais objetivos de pesquisa do QMUL/WHRI é apoiar a pesquisa cardíaca.

Coleta e armazenamento de amostras:

Após o consentimento informado por escrito, todos os pacientes serão classificados no pré-operatório por meio de ASA, Euroscore 2 e classificados de risco convencionalmente para o desenvolvimento de infecção do sítio cirúrgico.

Sangue (total de 44ml) será coletado de 150 pacientes para substituição da válvula aórtica imediatamente antes da cirurgia (T0).

O sangue (7ml) será coletado em um tubo PAXgene e armazenado a -80° para posterior análise genética. Uma amostra coagulada (7ml) será coletada em um tubo SST de tampa dourada padrão, deixada para coagular e então centrifugada por 10 minutos a 1000g, o soro separado e armazenado a -80° para posterior análise dos níveis de anticorpos. Além disso, 30 ml de sangue serão coletados para estudo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), coletadas em tubos de EDTA (anticoagulante) de tampa roxa padrão. Estes serão separados dentro de 3 horas após a coleta por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Paque, em que o sangue diluído em PBS é cuidadosamente colocado sobre Ficoll e centrifugado em uma centrífuga a 400 g por 30 minutos. A camada de PBMC é então extraída e lavada duas vezes em PBS e armazenada em solução de congelamento de dimetil sulfóxido a 10% em nitrogênio líquido para que possam ser descongeladas e analisadas em lote posteriormente.

Análise de amostra:

As PBMCs serão contadas usando um hemocitômetro, então cultivadas em RPMI e 10% de soro com LPS, α-toxina ou não estimuladas por 24 horas, após o que serão analisadas imediatamente conforme detalhado abaixo.

• Mediadores Solúveis (Plasma)

• Armazenamento: O sangue anticoagulado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9mL) será centrifugado (1200g, 10 minutos, 20°C) e o plasma armazenado a -80°C dentro de 2 horas após a coleta
• Análise:

Citocinas: Meso Scale Discovery (MSD) O Painel Pró-inflamatório V-PLEX 1 será empregado para quantificar IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-8 e TNF-α. As placas serão lidas usando um gerador de imagens MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Anticorpos: Serão medidos por meio de ensaios de ELISA contra antígenos estafilocócicos (α-toxina, ácido teicóico) e porções centrais da molécula de endotoxina (EndoCAb).

• Liberação estimulada de citocinas por LPS/α-toxina de sangue total

  • Técnica: Conforme previamente descrito e validado em nosso laboratório, o sangue heparinizado será estimulado por 4 horas (37°C, 250rpm) com 1ng/ml de LPS dentro de 2 horas após a coleta. Após a incubação, as amostras serão centrifugadas (1200g, 10mins, 20°C) e o sobrenadante armazenado a -80°C.
  • Quantificação de citocinas: Conforme 'mediadores solúveis' MSD V-PLEX Pro-inflamatório Painel 1 será empregado para quantificar TNF-α (resultado primário como métrica de competência imunológica) e outras citocinas. As citocinas serão expressas como um fator do número de monócitos circulantes.

• Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo e Avaliação Funcional de Leucócitos

  • Citometria de Fluxo: Todas as amostras serão analisadas na mesma máquina (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). A padronização e a comparação da saída serão alcançadas por meio do emprego de tensões constantes e matriz de compensação com correspondência diária de valores para um único lote de esferas (BD) de Configuração e Rastreamento de Citometria (CS&T). A coloração da superfície celular de leucócitos será realizada usando anticorpos fornecidos principalmente pela BD. A coloração, captura de dados e armazenamento serão conduzidos de acordo com um único procedimento operacional padrão de estudo. 5 painéis (até 14 cores) e dois ensaios funcionais serão realizados em cada ponto de tempo. Os dados serão analisados ​​no FlowJo versão 10.5.
  • Coloração de marcador de superfície:

Painel de quantificação e calibração: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, realizado em um tubo BD TruCount para permitir a enumeração de subconjuntos de células Painéis específicos de células (incorporando marcadores de subcategorização e marcadores de competência imunológica)

• Monócitos/Mieloides: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrófilos: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Linfócito: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 Expressão HLA-DR: Será quantificado em monócitos CD14+ usando esferas BD QuantiBrite.

  • Medidas Funcionais Fagocitose: A capacidade dos neutrófilos e monócitos para fagocitar bactérias E.coli marcadas com FITC opsonizadas será quantificada através do ensaio FagoTest (BD) de acordo com as instruções do fabricante 'explosão' de oxigênio reativo: A determinação quantitativa da explosão oxidativa de leucócitos será realizada usando o ensaio PhagoBurst (BD) em resposta a E.coli opsonizada não marcada, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e o peptídeo quimiotático N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP).

o As PBMCs da amostra pré-cirúrgica que serão estimuladas com LPS (tipo e concentração a serem otimizados via curva dose-resposta em voluntários saudáveis) e α-toxina serão submetidas a citometria de fluxo para medir a expressão de superfície de TLR4 e TLR5, expressão de superfície de HLA-DR e quantificação de NF-kB utilizando anticorpos apropriados validados na literatura. No final da estimulação, as células serão colhidas e o RNA extraído para (q)PCR quantitativo para avaliar a expressão de AID mRNA. Embora as células B nas culturas de PBMC tenham sido estimuladas na presença de outros tipos de células, principalmente células T e monócitos-macrófagos, nosso objetivo é medir uma resposta de células B, já que a AID é expressa exclusivamente em células B.

Sangue voluntário saudável suficiente está disponível para que todas as técnicas acima possam ser adequadamente praticadas e otimizadas antes do recrutamento do paciente.

Outros pontos de tempo de amostragem serão imediatamente pós-operatório (T1), 24h pós-operatório (T2), alta (T3) e 4 semanas pós-operatório no acompanhamento cirúrgico (T4). O sangue coletado em 4 semanas de acompanhamento pós-cirúrgico será testado para ensaio de anticorpos IgG para EndoCAb, α-toxina e ácido teicóico. Isso permitirá uma medida de recombinação de troca de classe. O que será referente ao grau de expressão do mRNA de AID.

A população de pacientes com substituição da válvula aórtica será acompanhada quanto à mortalidade e morbidade maior. Eles serão pontuados de acordo com C-POMS (escore de morbidade pós-operatória cardíaca), tempo de internação na UTI e tempo de internação. Os pacientes serão monitorados quanto ao desenvolvimento de infecção do sítio cirúrgico (ISC) ou aquisição de infecção hospitalar pós-operatória (IRAS). O acompanhamento pós-alta para infecção ou ruptura da ferida será continuado por 12 meses.

No momento pré-operatório imediato (T0), juntamente com as medidas atualmente aceitas de resposta imune, pretende-se realizar um teste de resposta imune (LIT) próximo ao paciente usando um dispositivo portátil de quimioluminescência que depende da explosão oxidativa de leucócitos a um estímulo supramáximo (Oxford Medistress). Isso depende da análise da resposta em uma amostra de sangue capilar fresco de 10mcl.

Considerações estatísticas:

A partir de dados publicados de centros em todo o mundo, sabe-se que uma proporção de pacientes desenvolve uma infecção, seja infecção do sítio cirúrgico (ISC) ou infecção adquirida no hospital (IRAS), após a cirurgia da válvula aórtica. Sabe-se também que esses pacientes permanecem mais tempo no hospital após a cirurgia.

Os investigadores demonstraram que entre estes doentes existe uma variabilidade nos níveis de anticorpos para várias ameaças perioperatórias, nomeadamente endotoxinas e estafilococos.

Os investigadores demonstraram que nos pacientes submetidos a cirurgia e com baixos níveis de anticorpos circulantes para endotoxinas e/ou estafilococos, existe uma associação com maior probabilidade de desenvolver uma infecção e maior tempo de internação pós-operatória. Os investigadores estimam que a taxa de infecção varie entre 13,5 - 33%.

Os pesquisadores sugeriram anteriormente que a associação entre o nível de anticorpos e o resultado pode ser a manifestação de uma capacidade prejudicada subjacente em alguns indivíduos de montar uma resposta imune normal a essas ameaças.

Sabe-se que uma proporção de indivíduos tem uma resposta imune anormal. Isso talvez seja mais obviamente visto na resposta à vacinação, onde trabalhos anteriores demonstraram a falta de resposta imune após vários programas de vacinação e nosso próprio trabalho sobre a resposta do EndoCAb à vacinação monovalente contra a febre tifóide. Essa responsividade não/ruim nesses estudos situa-se entre 10 e 40%. O diagrama ilustra a proporção de não respondedores (ou seja, baixa capacidade de resposta imune) se eles estiverem igualmente distribuídos.