Dépistage à grande échelle de la population COVID-19

Les transmissions rapides d'hôte à hôte associées à la facilité des voyages internationaux ont conduit à des épidémies telles que le H5N1, le H5N5, le SRAS et, plus récemment, la pandémie de COVID-19. Les mesures traditionnelles de lutte contre les épidémies, telles que la recherche des contacts et l'isolement physique, sont primordiales pour atténuer l'étendue de la propagation de la maladie au stade précoce de la pandémie et ces stratégies dépendent de la précision et de la rapidité du diagnostic des patients suspects.

Aujourd'hui, l'étalon-or pour la détection d'agents pathogènes est la détection d'acide nucléique par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cependant, cette stratégie est limitée par le délai d'exécution, la machine PCR coûteuse et le nombre potentiel d'infections. Ainsi, d'autres méthodes d'amplification isotherme sont souvent utilisées pour contourner le besoin d'instrumentation supplémentaire et accélérer l'ensemble de la procédure de détection.

Une approche pour améliorer l'efficacité du dépistage des maladies infectieuses est le test Dorfman populaire, où les échantillons sont regroupés et testés en même temps pour réduire le nombre total de tests effectués. Cependant, le test de Dorfman est limité à une population à faible prévalence et a une sensibilité réduite ; Une stratégie de codage à barres a également été introduite pour résoudre le test d'échantillon de regroupement. En 2020, Schmid-Burk et ses collègues ont combiné le LAMP et le codage à barres qui ont développé avec succès COVID-19 à partir de 100 000 échantillons regroupés. Cependant, le besoin d'un séquenceur de nouvelle génération coûteux limite son utilisation généralisée.

Méthodes

La plate-forme proposée vise le développement d'un processus en plusieurs étapes dans un seul appareil et la capacité d'identifier la source de signaux positifs à partir d'échantillons regroupés. La conception proposée tirera parti d'une stratégie de codes à barres pour étiqueter plusieurs sources d'analytes avant le regroupement, une combinaison d'amplification isotherme et de détection électrochimique spécifique à la séquence, et l'intégration de plusieurs étapes dans un dispositif simple. La méthodologie du projet de recherche sera divisée en trois parties.

(i) Développer une méthode d'amplification isotherme et de détection en temps réel à l'aide de sondes oligonucléotidiques à boucle marquée électroactivement

Les enquêteurs ont récemment conceptualisé une méthode, pour laquelle les enquêteurs ont déposé une protection par brevet provisoire aux États-Unis. Cette nouvelle technique effectue l'amplification isotherme et la détection électrochimique des amplicons simultanément sur la base de l'amplification isotherme médiée par la boucle (LAMP). Le schéma proposé implique un système d'amplification et de détection à pot unique dans lequel un rapporteur électrochimique est attaché à l'une des amorces et une enzyme de coupure est ajoutée pour cliver le rapporteur uniquement lorsque l'amplification se produit. Dans une réaction, une matrice d'ADN est conçue pour avoir deux paires de sites de liaison d'amorce : une paire externe d'amorces avant et arrière (FP et BP) et une paire interne d'amorces, à savoir une sonde à boucle marquée électrochimiquement (LP) et une sonde auxiliaire (AP). Le FP et le LP se lient au même brin de la matrice d'ADN double brin (dsDNA) tandis que le BP et l'AP se lient au brin opposé. Le LP contient un marqueur électroactif à l'extrémité 5' et un segment en surplomb en 3' complémentaire de la séquence d'ADN cible. La région souche contient la séquence de reconnaissance d'une enzyme de coupure, mais un mésappariement est introduit dans le dernier nucléotide afin qu'il ne soit pas clivé sans la présence de l'ADN cible. Le début de la réaction est similaire à la LAMP ordinaire, un amplicon à double boucle peut être produit et la réaction peut entrer dans l'étape d'amplification à double boucle. Chacun des amplicons à double boucle peut être considéré comme une unité d'amplification de signal. Une fois que le LP marqué est combiné avec l'amplicon et forme un site de clivage qui peut être reconnu par l'enzyme nick, un marqueur électroactif peut être libéré et un signal électrochimique sera généré. Les résultats préliminaires indiquent que la stratégie est capable de détecter jusqu'à 0,1 fg/μL, correspondant à environ 10 copies/μL de l'ADN d'entrée, en utilisant un reporter électroactif au bleu de méthylène sur des électrodes de carbone sérigraphiées à quatre réseaux (SPCE) dans 30 minutes. Les étapes suivantes comprennent l'incorporation d'une étape de transcription inverse pour la détection d'échantillons d'ARN et le test du système dans des matrices complexes pour imiter les fluides biologiques réels.

(ii) Concevoir une stratégie moléculaire pour coder à barres quatre échantillons individuels afin qu'ils puissent être regroupés et pour amplifier et identifier simultanément l'individu positif, le cas échéant, à partir de l'échantillon regroupé.

En concevant quatre séquences de code-barres, les chercheurs sont capables de construire des produits d'ADNc marqués par transcription inverse par l'enzyme BST. L'exonucléase thermolabile I est ajoutée pour digérer les amorces de code à barres simple brin n'ayant pas réagi. De plus, le produit duplex ADNc-ARN est digéré par la RNase H pour donner un ADNc simple brin (modèle ID). Le mélange mis en commun de modèles ID est amplifié par le même processus décrit dans la section précédente. Seuls les échantillons contenant le virus à ARN généreront des signaux électrochimiques positifs.

Dans cette partie, les chercheurs utiliseront l'ARN du virus de synthèse ou l'ARN total du virus extrait commercial comme matrice de détection. Les échantillons dopés peuvent être simulés en les mélangeant avec de la salive de gorge profonde humaine ou des écouvillons nasopharyngés de volontaires sains.

(iii) Fabriquer un dispositif microfluidique pour intégrer le processeur d'échantillons et le module de codage à barres à l'étape d'amplification et de détection des acides nucléiques pour le dépistage à grande échelle de la population

Dans ce projet, les chercheurs conçoivent un dispositif de type stylo microfluidique simple et facile à utiliser qui intègre les étapes de préparation des échantillons, de codage à barres, d'amplification et de détection. Il utilise la propulsion à piston pour fournir la puissance nécessaire pour pousser l'échantillon dans différentes chambres. Tout d'abord, les échantillons fictifs sont ajoutés dans une chambre de chargement d'échantillons où le tampon de lyse est stocké. Un mélange de surfactine, de SDS et d'éthanol permet l'extraction rapide de l'acide nucléique viral, qui est ensuite injecté dans la chambre d'identification contenant le mélange lyophilisé de polymérase BST et d'amorce ID-tag. La température restera à 37°C-50°C pour la transcription inverse. Ensuite, l'échantillon est injecté dans la chambre contenant l'exonucléase thermolabile I. Le bloc chauffant est ensuite réglé à 65 ° C pendant 5 min pour désactiver l'enzyme. Par la suite, les quatre échantillons sont regroupés et injectés dans une puce de détection électrochimique sous le stylo microfluidique. Chaque puce contient quatre ensembles d'amorces et de LP avec différents rapporteurs électroactifs avec des potentiels redox non chevauchants pour déclencher la réaction d'amplification en présence des séquences d'identification respectives des participants.

La chambre de détection se trouve au sommet d'un poste de travail électrochimique multicanal, qui consiste en un port de connexion entre le capteur électrochimique et le détecteur, une carte de circuit imprimé et une ligne d'alimentation pour l'affichage externe. La carte de circuit imprimé est principalement composée d'un microcontrôleur, d'un convertisseur numérique-analogique et d'un module potentiostat pour permettre une analyse de voltamétrie différentielle à impulsions et obtenir simultanément les signaux d'un réseau d'électrodes et ainsi détecter un total de 100 échantillons.

(iv) Valider les performances du prototype à l'aide d'un échantillon clinique et le comparer aux données de détection des équipements de test disponibles dans le commerce.

La méthode proposée de test d'échantillons regroupés sera comparée au test RT-PCR de référence en termes de sensibilité, de spécificité, de valeur prédictive positive, de valeur prédictive négative et de précision. Après avoir démontré la validité des résultats obtenus à partir de la stratégie de mise en commun proposée, les enquêteurs exploreront ensuite la possibilité d'utiliser des échantillons de salive et de gargarisme buccal au lieu des écouvillons nasopharyngés. Les patients seront recrutés à l'hôpital Prince of Wales pour la collecte d'échantillons respiratoires afin de déterminer la précision de cet appareil.

A. Procédures d'étude

1. Dossiers médicaux des participants pour recueillir des données cliniques, notamment l'âge, le sexe, le nombre de jours après l'apparition des symptômes, l'exposition épidémiologique à des personnes atteintes d'une maladie COVID-19 confirmée, la gravité (légère, modérée, grave ou critique) et la présence de les comorbidités seront examinées.
2. Les résultats de la PCR SARS-CoV-2 des participants à partir du dossier électronique de l'hôpital seront récupérés.
3. Un écouvillon nasopharyngé, un échantillon de salive de gorge profonde et/ou de gargarisme buccal de chaque patient recruté seront prélevés.

B. Procédures de laboratoire et analyses des données

1. Préparation des échantillons Les échantillons prélevés sur les 200 patients seront d'abord divisés en deux ensembles avec une prévalence similaire, et chaque taille d'échantillon est de 100. Le premier ensemble de 100 échantillons sera extrait à l'aide de kits commerciaux d'extraction d'ARN viral fournis par HKUST, puis sera stocké pour une analyse RT-qPCR plus poussée et la vérification de la méthode basée sur LAMP.
2. Essai RT-qPCR Pour préparer le résultat RT-qPCR comme référence, les échantillons extraits de ceux mentionnés ci-dessus seront analysés à l'aide de RT-qPCR pour la détection qualitative et quantitative de l'acide nucléique du SRAS-CoV-2, et un négatif, un positif et une expérience de contrôle à blanc doit être incluse. Les valeurs des seuils de cycle (Ct), les résultats qualitatifs et quantitatifs de chaque échantillon seront enregistrés. Les procédures de RT-qPCR seront suivies par les directives existantes recommandées par le CDC. L'amorce qPCR et les ensembles de sondes Taqman, et la référence standard d'ARN SARS-CoV-2 seront fournis par HKUST.
3. Expériences d'échantillons regroupés Le deuxième ensemble de 100 échantillons inactivés sera divisé en 25 groupes au hasard (chacun pour 4 échantillons), et les enquêteurs effectueront des tests de groupe SARS-CoV-2 pour les 25 pools à l'aide du dispositif microfluidique développé ci-dessus avec des chercheurs de HKUST. Sur la base des résultats de la RT-qPCR, la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives seront calculées pour une analyse plus approfondie des données par HKUST.

Conduite de l'étude

Cette étude sera menée conformément à la Déclaration d'Helsinki.