Storskala COVID-19 befolkningsundersøkelse

Raske vert-til-vert-overføringer kombinert med den enkle internasjonale reiser har ført til epidemier som H5N1, H5N5, SARS, og sist, COVID-19-pandemien. Tradisjonelle epidemiske kontrolltiltak, som kontaktsporing og fysisk isolasjon, er avgjørende for å redusere omfanget av sykdomsspredning på et tidlig stadium av pandemien, og disse strategiene avhenger av nøyaktigheten og hastigheten på diagnostisering av mistenkte pasienter.

Nå er gullstandarden for patogendeteksjon nukleinsyredeteksjon via polymerasekjedereaksjon (PCR). Imidlertid er denne strategien begrenset av behandlingstiden, kostbar PCR-maskin og potensielt antall infeksjoner. Derfor brukes ofte andre isotermiske amplifikasjonsmetoder for å omgå behovet for ekstra instrumentering og fremskynde hele deteksjonsprosedyren.

En tilnærming for å forbedre effektiviteten av screening av smittsomme sykdommer er den populære Dorfman-testingen, hvor prøver slås sammen og testes samtidig for å redusere det totale antallet utførte tester. Dorfman-testingen er imidlertid begrenset til lavprevalenspopulasjon og har redusert sensitivitet; Strekkodingsstrategi har også blitt introdusert for å løse prøvesamlingstest. I 2020 kombinerte Schmid-Burk og hans kolleger LAMP og strekkoding som med suksess utviklet COVID-19 fra 100 000 samlede prøver. Imidlertid begrenser behovet for en kostbar neste generasjons sequencer den utbredte bruken.

Metoder

Den foreslåtte plattformen tar sikte på utvikling av en flertrinnsprosess i én enhet, og muligheten til å identifisere kilden til positive signaler fra samleprøver. Det foreslåtte designet vil dra nytte av en strekkodestrategi for å merke flere analytter før sammenslåing, en kombinasjon av isotermisk amplifikasjon og sekvensspesifikk elektrokjemisk deteksjon, og integrering av flere trinn i en enkel enhet. Forskningsprosjektmetodikken vil deles inn i tre deler.

(i) Å utvikle en isotermisk amplifikasjonsmetode og sanntidsdeteksjon ved bruk av elektroaktivt merkede sløyfeoligonukleotidprober

Etterforskerne har nylig konseptualisert en metode som etterforskerne har innlevert en amerikansk provisorisk patentbeskyttelse for. Denne nye teknikken utfører isotermisk forsterkning og elektrokjemisk deteksjon av amplikoner samtidig basert på Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP). Det foreslåtte opplegget involverer et én-pots amplifikasjons- og deteksjonssystem der en elektrokjemisk reporter er festet til en av primerne og et nicking-enzym tilsettes for å spalte reporteren bare når amplifikasjon skjer. I en reaksjon er et templat-DNA utformet for å ha to par primerbindingsseter: et ytre par forover- og bakoverprimere (FP og BP) og et indre par primere, nemlig en elektrokjemisk merket loop-probe (LP) og en assistentsonde (AP). FP og LP binder seg til den samme tråden av den dobbelttrådete DNA (dsDNA)-malen mens BP og AP binder seg til den motsatte tråden. LP inneholder en elektroaktiv markør ved 5'-enden og et 3'-overhengende segment komplementært til mål-DNA-sekvensen. Stammeregionen inneholder gjenkjennelsessekvensen til et nicking-enzym, men en mismatch blir introdusert til det siste nukleotidet slik at det ikke vil bli spaltet uten tilstedeværelse av mål-DNA. Starten av reaksjonen ligner på vanlig LAMP, en dobbelsløyfe-amplikon kan produseres, og reaksjonen kan komme inn i dobbelsløyfe-amplifikasjonsstadiet. Hver av dobbeltsløyfeforsterkerne kan betraktes som en signalforsterkerenhet. Når den merkede LP er kombinert med amplikonet og danner et spaltningssted som kan gjenkjennes av nick-enzymet, kan en elektroaktiv markør frigjøres, og et elektrokjemisk signal vil bli generert. De foreløpige resultatene indikerer at strategien er i stand til å oppdage opptil 0,1 fg/μL, tilsvarende rundt 10 kopier/μL av input-DNA, ved å bruke en metylenblå elektroaktiv reporter på fire-array screen-printed karbonelektroder (SPCE) innenfor 30 min. De påfølgende trinnene inkluderer inkorporering av et omvendt transkripsjonstrinn for påvisning av RNA-prøver og testing av systemet i komplekse matriser for å etterligne faktiske biologiske væsker.

(ii) Å utforme en molekylær strategi for å strekkode fire individuelle prøver slik at de kan slås sammen og samtidig forsterke og identifisere det positive individet, hvis noen, fra den samlede prøven.

Ved å designe fire strekkodesekvenser er etterforskerne i stand til å konstruere merkede cDNA-produkter gjennom revers transkripsjon av BST-enzym. Termolabil eksonuklease I tilsettes for å fordøye ureagerte enkeltstrengs strekkodeprimere. I tillegg fordøyes cDNA-RNA-dupleksproduktet av RNase H for å gi et enkelttrådet cDNA (ID-mal). Den sammenslåtte blandingen av ID-maler amplifiseres gjennom samme prosess som beskrevet i forrige avsnitt. Bare de prøvene med RNA-viruset vil generere positive elektrokjemiske signaler.

I denne delen vil etterforskerne bruke syntesevirus RNA eller kommersielt ekstrahert virus totalt RNA som en deteksjonsmal. De tilsatte prøvene kan spottes ved å blande med spytt fra menneskelig dyp hals eller nasofaryngeale vattpinner fra friske frivillige.

(iii) Å fremstille en mikrofluidisk enhet for å integrere prøveprosessoren og strekkodemodulen med nukleinsyreamplifikasjons- og deteksjonstrinnet for storskala populasjonsscreening

I dette prosjektet designer etterforskerne en enkel og brukervennlig mikrofluidisk pennlignende enhet som integrerer trinnene med prøvepreparering, strekkoding og amplifikasjon og deteksjon. Den bruker stempelfremdrift for å gi kraft til å skyve prøven inn i forskjellige kamre. Først legges de falske prøvene til et prøveinnlastingskammer hvor lyseringsbufferen lagres. En blanding av surfaktin, SDS og etanol tillater rask ekstraksjon av viral nukleinsyre, som deretter injiseres ned til identifikasjonskammeret som inneholder den frysetørkede BST-polymerase og ID-tag-primerblandingen. Temperaturen vil holde seg på 37 °C-50 °C for omvendt transkripsjon. Deretter injiseres prøven til kammeret som inneholder termolabil eksonuklease I. Varmeblokken settes deretter til 65 °C i 5 minutter for å deaktivere enzymet. Deretter slås de fire prøvene sammen og injiseres i en elektrokjemisk deteksjonsbrikke under den mikrofluidiske pennen. Hver brikke inneholder fire sett med primere og LP-er med forskjellige elektroaktive reportere med ikke-overlappende redokspotensialer for å utløse amplifikasjonsreaksjonen i nærvær av respektive deltakers ID-sekvenser.

Deteksjonskammeret sitter på toppen av en flerkanals elektrokjemisk arbeidsstasjon, som består av en tilkoblingsport mellom den elektrokjemiske sensoren og detektoren, et kretskort og en strømledning for ekstern skjerm. Kretskortet er hovedsakelig sammensatt av en mikrokontrollerenhet, en digital-til-analog-omformer og en potensiostatmodul for å tillate differensiell pulsvoltammetrianalyse og samtidig hente signalene fra en rekke elektroder og dermed oppdage totalt 100 prøver.

(iv) Å validere ytelsen til prototypen ved å bruke en klinisk prøve og måle den mot deteksjonsdata fra kommersielt tilgjengelig testutstyr.

Den foreslåtte metoden for samlet prøvetesting vil bli sammenlignet med gullstandard RT-PCR-testen når det gjelder sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi, negativ prediktiv verdi og nøyaktighet. Etter å ha demonstrert gyldigheten av resultatene oppnådd fra den foreslåtte sammenslåingsstrategien, vil etterforskerne undersøke muligheten for å bruke spytt- og munngurgleprøver i stedet for nasofaryngeale vattpinner. Pasienter vil bli rekruttert fra Prince of Wales Hospital for innsamling av luftveisprøver for å bestemme nøyaktigheten til denne enheten.

A. Studieprosedyrer

1. Deltakernes medisinske journaler for å samle inn kliniske data, inkludert alder, kjønn, antall dager etter symptomdebut, epidemiologisk eksponering for personer med bekreftet COVID-19-sykdom, alvorlighetsgrad (mild, moderat, alvorlig eller kritisk) og tilstedeværelse av komorbiditeter vil bli vurdert.
2. SARS-CoV-2 PCR-resultater fra deltakerne fra sykehusets elektroniske journal vil bli hentet.
3. Nasofaryngeal vattpinne, spytt fra dyp hals og/eller munngurgleprøve fra hver rekruttert pasient vil bli samlet inn.

B. Laboratorieprosedyrer og dataanalyser

1. Prøveforberedelse Prøvene som samles inn fra de 200 pasientene vil først bli delt i to sett med lignende prevalens, og hver prøvestørrelse er 100. Det første settet med 100 prøver vil bli ekstrahert ved å bruke kommersielle virale RNA-ekstraksjonssett levert av HKUST, og deretter lagres for videre RT-qPCR-analyse og den LAMP-baserte metodeverifiseringen.
2. RT-qPCR-analyse For å forberede RT-qPCR-resultatet som referanse, vil de ekstraherte prøvene fra nevnt ovenfor bli analysert ved bruk av RT-qPCR for kvalitativ og kvantitativ påvisning av nukleinsyre fra SARS-CoV-2, og en negativ, en positiv og et blankt kontrolleksperiment bør inkluderes. Syklusterskelverdiene (Ct), kvalitative og kvantitative resultater for hver prøve vil bli registrert. RT-qPCR-prosedyrene vil bli fulgt av eksisterende CDC-anbefalte retningslinjer. qPCR-primer- og Taqman-probesettene og SARS-CoV-2 RNA-standardreferanse vil bli gitt av HKUST.
3. Samlede prøveeksperimenter Det andre settet med 100 inaktiverte prøver vil bli delt inn i 25 grupper tilfeldig (hver for 4 prøver), og etterforskerne vil utføre SARS-CoV-2 gruppetesting for de 25 bassengene ved å bruke den mikrofluidiske enheten utviklet ovenfor med HKUST-forskere. Basert på RT-qPCR-resultatene, vil sensitivitet, spesifisitet og positive og negative prediktive verdier bli beregnet for videre dataanalyse av HKUST.

Studieoppførsel

Denne studien vil bli utført i samsvar med Helsinki-erklæringen.