대규모 COVID-19 인구 선별 검사

해외 여행의 용이성과 결합된 빠른 호스트 간 전송으로 인해 H5N1, H5N5, SARS 및 가장 최근에는 COVID-19 대유행과 같은 전염병이 발생했습니다. 접촉 추적 및 물리적 격리와 같은 전통적인 방역 조치는 대유행 초기 단계에서 질병 확산 정도를 완화하는 데 가장 중요하며 이러한 전략은 의심 환자 진단의 정확성과 속도에 달려 있습니다.

이제 병원체 검출의 황금 표준은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 핵산 검출입니다. 그러나 이 전략은 처리 시간, 값비싼 PCR 기계 및 잠재적인 감염 수로 인해 제한됩니다. 따라서 다른 등온 증폭 방법은 종종 추가 장비의 필요성을 피하고 전체 감지 절차를 가속화하는 데 사용됩니다.

전염병 선별 효율성을 개선하기 위한 한 가지 접근 방식은 인기 있는 Dorfman 테스트로, 샘플을 함께 모으고 동시에 테스트하여 수행되는 총 테스트 수를 줄입니다. 그러나 Dorfman 테스트는 유병률이 낮은 모집단으로 제한되며 민감도가 감소합니다. 풀링 샘플 테스트를 해결하기 위해 바코드 전략도 도입되었습니다. 2020년에 Schmid-Burk와 그의 동료들은 LAMP와 바코드를 결합하여 100,000개의 풀 샘플에서 COVID-19를 성공적으로 개발했습니다. 그러나 값비싼 차세대 시퀀서의 필요성으로 인해 널리 사용되는 데 제한이 있습니다.

행동 양식

제안된 플랫폼은 하나의 장치에서 다단계 프로세스를 개발하고 풀링된 샘플에서 양성 신호의 소스를 식별하는 기능을 목표로 합니다. 제안된 디자인은 풀링, 등온 증폭 및 시퀀스별 전기화학 검출의 조합, 하나의 간단한 장치에 여러 단계를 통합하기 전에 여러 분석 소스에 태그를 지정하는 바코드 전략을 활용할 것입니다. 연구 프로젝트 방법론은 세 부분으로 나뉩니다.

(i) 등온 증폭 방법 및 전기활성 표지 루프 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 실시간 검출 방법 개발

조사관은 최근 조사관이 미국 임시 특허 보호를 신청한 방법을 개념화했습니다. 이 새로운 기술은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 기반으로 앰플리콘의 등온 증폭 및 전기화학적 검출을 동시에 수행합니다. 제안된 방식은 전기화학 리포터가 프라이머 중 하나에 부착되고 증폭이 발생할 때만 리포터를 절단하기 위해 nicking 효소가 추가되는 원팟 증폭 및 검출 시스템을 포함합니다. 한 반응에서, 주형 DNA는 두 쌍의 프라이머 결합 부위를 가지도록 설계됩니다: 전방 및 후방 프라이머의 외부 쌍(FP 및 BP)과 내부 프라이머 쌍, 즉 전기화학적으로 표지된 루프 프로브(LP) 및 보조 프로브(AP). FP와 LP는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 주형의 동일한 가닥에 결합하고 BP와 AP는 반대 가닥에 결합합니다. LP는 5' 말단에 전기활성 라벨과 표적 DNA 서열에 상보적인 3' 오버행 세그먼트를 포함합니다. 줄기 영역에는 nicking 효소의 인식 서열이 포함되어 있지만 마지막 뉴클레오티드에 불일치가 도입되어 표적 DNA가 없으면 절단되지 않습니다. 반응의 시작은 일반 LAMP와 유사하며, 이중 루프 앰플리콘이 생성될 수 있으며, 반응은 이중 루프 증폭 단계로 올 수 있습니다. 각각의 이중 루프 앰플리콘은 신호 증폭 장치로 간주될 수 있습니다. 표지된 LP가 앰플리콘과 결합하여 닉 효소에 의해 인식될 수 있는 절단 부위를 형성하면 전기활성 표지가 방출될 수 있으며 전기화학적 신호가 생성됩니다. 예비 결과는 이 전략이 내부의 4개 어레이 스크린 인쇄 탄소 전극(SPCE)에서 메틸렌 블루 전기활성 리포터를 사용하여 입력 DNA의 약 10copy/μL에 해당하는 최대 0.1fg/μL까지 감지할 수 있음을 나타냅니다. 30 분. 후속 단계에는 RNA 샘플 검출을 위한 역전사 단계를 통합하고 실제 생물학적 유체를 모방하기 위해 복잡한 매트릭스에서 시스템을 테스트하는 것이 포함됩니다.

(ii) 4개의 개별 샘플을 바코드화하여 함께 풀링할 수 있도록 하고 풀링된 샘플에서 양성 개인이 있는 경우 이를 동시에 증폭하고 식별하는 분자 전략을 설계합니다.

4개의 바코드 서열을 디자인함으로써 연구자들은 BST 효소에 의한 역전사를 통해 태그가 붙은 cDNA 제품을 구성할 수 있습니다. 반응하지 않은 단일 가닥 바코드 프라이머를 분해하기 위해 Thermolabile exonuclease I이 추가됩니다. 또한, cDNA-RNA 듀플렉스 산물은 RNase H에 의해 소화되어 단일 가닥 cDNA(ID-템플릿)를 생성합니다. 풀링된 ID-템플릿 혼합물은 이전 섹션에서 설명한 동일한 프로세스를 통해 증폭됩니다. RNA 바이러스가 있는 샘플만 양성 전기화학적 신호를 생성합니다.

이 부분에서 조사관은 합성 바이러스 RNA 또는 상업적으로 추출된 바이러스 총 RNA를 검출 템플릿으로 사용합니다. 스파이크된 샘플은 인간의 심부 타액 또는 건강한 지원자의 비인두 면봉과 ​​혼합하여 조롱할 수 있습니다.

(iii) 대규모 인구 스크리닝을 위한 핵산 증폭 및 검출 단계와 샘플 프로세서 및 바코드 모듈을 통합하는 미세유체 장치를 제작하기 위함

이 프로젝트에서 연구자들은 샘플 준비, 바코드, 증폭 및 검출 단계를 통합하는 간단하고 사용하기 쉬운 미세 유체 펜형 장치를 설계합니다. 피스톤 추진력을 사용하여 샘플을 다른 챔버로 밀어 넣을 수 있는 힘을 제공합니다. 먼저 모의 샘플을 용해 버퍼가 저장된 샘플 로딩 챔버에 추가합니다. 서팩틴, SDS 및 에탄올의 혼합물을 사용하면 바이러스 핵산을 신속하게 추출할 수 있으며, 이는 동결 건조된 BST 폴리머라제 및 ID-태그 프라이머 혼합물을 포함하는 식별 챔버로 주입됩니다. 온도는 역전사를 위해 37°C-50°C로 유지됩니다. 그런 다음 열 불안정성 엑소뉴클레아제 I이 들어 있는 챔버에 시료를 주입합니다. 그런 다음 가열 블록을 65°C로 5분 동안 설정하여 효소를 비활성화합니다. 그 후, 4개의 샘플을 함께 모아 미세유체 펜 아래의 전기화학적 검출 칩에 주입한다. 각 칩에는 각각의 참여자의 ID 서열이 있을 때 증폭 반응을 유발하기 위해 중첩되지 않는 산화환원 전위를 가진 서로 다른 전기활성 리포터가 있는 4세트의 프라이머 및 LP가 포함되어 있습니다.

검출 챔버는 전기화학 센서와 검출기 사이의 연결 포트, 회로 기판 및 외부 디스플레이용 전력선으로 구성된 다중 채널 전기화학 워크스테이션 위에 있습니다. 회로 기판은 주로 마이크로컨트롤러 장치, 디지털-아날로그 변환기 및 전위차 모듈로 구성되어 차동 펄스 전압 전류 분석을 허용하고 동시에 전극 배열에서 신호를 얻어 총 100개의 샘플을 감지합니다.

(iv) 임상 표본을 사용하여 프로토타입의 성능을 검증하고 시중에서 판매되는 테스트 장비의 검출 데이터와 비교하여 벤치마킹합니다.

제안된 합동 검체 검사 방법은 민감도, 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도 및 정확도 측면에서 gold standard RT-PCR 검사와 비교될 것입니다. 제안된 풀링 전략에서 얻은 결과의 타당성을 입증한 후 조사관은 비인두 면봉 대신 타액 및 구강 가글 샘플을 사용할 가능성을 탐색할 것입니다. 이 장치의 정확도를 결정하기 위해 호흡기 샘플을 수집하기 위해 Prince of Wales 병원에서 환자를 모집합니다.

가. 연구절차

1. 연령, 성별, 증상 발생 후 일수, COVID-19 질병이 확인된 사람에 대한 역학적 노출, 중증도(경증, 중등도, 중증 또는 중대), 동반 질환을 검토하게 됩니다.
2. 병원 전자 기록에서 참가자의 SARS-CoV-2 PCR 결과가 검색됩니다.
3. 모집된 각 환자의 비인두 면봉, 깊은 인후 타액 및/또는 구강 가글 샘플을 수집합니다.

B. 실험실 절차 및 데이터 분석

1. 샘플 준비 200명의 환자로부터 수집된 샘플은 먼저 유병률이 유사한 두 세트로 나뉘며 각 샘플 크기는 100입니다. 첫 번째 세트 100개 샘플은 HKUST에서 제공하는 상용 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 추출한 다음 추가 RT-qPCR 분석 및 LAMP 기반 방법 검증을 위해 보관됩니다.
2. RT-qPCR 분석 RT-qPCR 결과를 기준으로 준비하기 위해 SARS-CoV-2 핵산의 정성 및 정량 검출을 위해 위에서 언급한 추출된 샘플을 RT-qPCR을 사용하여 분석하고 음성, 양성 블랭크 컨트롤 실험이 포함되어야 합니다. 주기 임계값(Ct) 값, 각 샘플의 정성 및 정량 결과가 기록됩니다. RT-qPCR 절차는 기존 CDC 권장 지침을 따릅니다. qPCR 프라이머 및 Taqman 프로브 세트, SARS-CoV-2 RNA 표준 참조는 HKUST에서 제공합니다.
3. 풀링된 샘플 실험 두 번째 세트 100개의 비활성화된 샘플은 무작위로 25개 그룹으로 나뉘고(각각 4개 샘플에 대해) 조사관은 HKUST 연구원과 함께 위에서 개발한 미세유체 장치를 사용하여 25개 풀에 대해 SARS-CoV-2 그룹 테스트를 수행합니다. RT-qPCR 결과를 기반으로 HKUST의 추가 데이터 분석을 위해 민감도, 특이도, 양성 및 음성 예측값이 계산됩니다.

연구 수행

이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행됩니다.