Detección de población de COVID-19 a gran escala

Las transmisiones rápidas de huésped a huésped, junto con la facilidad de los viajes internacionales, han dado lugar a epidemias como H5N1, H5N5, SARS y, más recientemente, la pandemia de COVID-19. Las medidas tradicionales de control de epidemias, como el rastreo de contactos y el aislamiento físico, son fundamentales para mitigar el alcance de la propagación de la enfermedad en la etapa inicial de la pandemia y estas estrategias dependen de la precisión y la velocidad del diagnóstico de los pacientes sospechosos.

Ahora, el estándar de oro para la detección de patógenos es la detección de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, esta estrategia está limitada por el tiempo de respuesta, la costosa máquina de PCR y la cantidad potencial de infecciones. Por lo tanto, a menudo se utilizan otros métodos de amplificación isotérmicos para eludir la necesidad de instrumentación adicional y acelerar todo el procedimiento de detección.

Un enfoque para mejorar la eficiencia de la detección de enfermedades infecciosas es la popular prueba de Dorfman, donde las muestras se agrupan y analizan al mismo tiempo para reducir la cantidad total de pruebas realizadas. Sin embargo, la prueba de Dorfman se limita a la población de baja prevalencia y tiene una sensibilidad reducida; También se ha introducido la estrategia de códigos de barras para resolver la prueba de muestras agrupadas. En 2020, Schmid-Burk y sus colegas combinaron LAMP y códigos de barras que desarrollaron con éxito COVID-19 a partir de 100 000 muestras agrupadas. Sin embargo, la necesidad de un secuenciador costoso de próxima generación limita su uso generalizado.

Métodos

La plataforma propuesta tiene como objetivo el desarrollo de un proceso de varios pasos en un dispositivo y la capacidad de identificar la fuente de señales positivas a partir de muestras agrupadas. El diseño propuesto aprovechará una estrategia de código de barras para etiquetar múltiples fuentes de analitos antes de la agrupación, una combinación de amplificación isotérmica y detección electroquímica específica de secuencia, y la integración de varios pasos en un dispositivo simple. La metodología del proyecto de investigación se dividirá en tres partes.

(i) Desarrollar un método de amplificación isotérmica y detección en tiempo real utilizando sondas de oligonucleótidos en asa marcadas electroactivamente

Los investigadores han conceptualizado recientemente un método, para el cual han presentado una protección de patente provisional en EE.UU. Esta nueva técnica realiza simultáneamente la amplificación isotérmica y la detección electroquímica de amplicones basada en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). El esquema propuesto implica un sistema de amplificación y detección de un solo recipiente en el que se une un indicador electroquímico a uno de los cebadores y se agrega una enzima de corte para escindir el indicador solo cuando se produce la amplificación. En una reacción, se diseña una plantilla de ADN para que tenga dos pares de sitios de unión de cebadores: un par externo de cebadores directos e inversos (FP y BP) y un par interno de cebadores, a saber, una sonda de bucle (LP) marcada electroquímicamente y una sonda de bucle (LP) marcada electroquímicamente. sonda auxiliar (AP). La FP y la LP se unen a la misma hebra de la plantilla de ADN de doble hebra (dsDNA), mientras que la BP y la AP se unen a la hebra opuesta. El LP contiene un marcador electroactivo en el extremo 5' y un segmento sobresaliente en 3' complementario a la secuencia de ADN diana. La región del tallo contiene la secuencia de reconocimiento de una enzima de corte, pero se introduce un desajuste en el último nucleótido para que no se escinda sin la presencia del ADN objetivo. El inicio de la reacción es similar a la LAMP ordinaria, se puede producir un amplicón de doble bucle y la reacción puede entrar en la etapa de amplificación de doble bucle. Cada uno de los amplicones de doble bucle se puede considerar como una unidad de amplificación de señal. Una vez que el LP marcado se combina con el amplicón y forma un sitio de escisión que puede ser reconocido por la enzima de corte, se puede liberar un marcador electroactivo y se generará una señal electroquímica. Los resultados preliminares indican que la estrategia es capaz de detectar hasta 0,1 fg/μL, lo que corresponde a alrededor de 10 copias/μL del ADN de entrada, mediante el uso de un indicador electroactivo de azul de metileno en electrodos de carbono serigrafiados (SPCE) de cuatro matrices dentro de 30 minutos. Los pasos posteriores incluyen la incorporación de un paso de transcripción inversa para la detección de muestras de ARN y la prueba del sistema en matrices complejas para imitar los fluidos biológicos reales.

(ii) Diseñar una estrategia molecular para codificar en barras cuatro muestras individuales de modo que puedan agruparse y amplificar e identificar simultáneamente al individuo positivo, si lo hubiera, de la muestra agrupada.

Mediante el diseño de cuatro secuencias de códigos de barras, los investigadores pueden construir productos de ADNc etiquetados a través de la transcripción inversa por la enzima BST. Se añade exonucleasa I termolábil para digerir los cebadores de código de barras de una sola hebra que no han reaccionado. Además, el producto dúplex cDNA-RNA es digerido por RNase H para producir un cDNA monocatenario (ID-plantilla). La mezcla agrupada de ID-plantillas se amplifica mediante el mismo proceso descrito en la sección anterior. Solo aquellas muestras con el virus de ARN generarán señales electroquímicas positivas.

En esta parte, los investigadores utilizarán ARN de virus de síntesis o ARN total de virus extraído comercialmente como plantilla de detección. Las muestras enriquecidas se pueden simular mezclándolas con saliva humana de garganta profunda o hisopos nasofaríngeos de voluntarios sanos.

(iii) Fabricar un dispositivo de microfluidos para integrar el procesador de muestras y el módulo de código de barras con el paso de amplificación y detección de ácidos nucleicos para la detección de poblaciones a gran escala.

En este proyecto, los investigadores diseñan un dispositivo similar a un bolígrafo de microfluidos simple y fácil de usar que integra los pasos de preparación de muestras, códigos de barras y amplificación y detección. Utiliza propulsión de pistón para proporcionar energía para empujar la muestra a diferentes cámaras. Primero, las muestras simuladas se agregan a una cámara de carga de muestras donde se almacena el tampón de lisis. Una mezcla de surfactina, SDS y etanol permite la extracción rápida de ácido nucleico viral, que luego se inyecta en la cámara de identificación que contiene la mezcla de cebador de etiqueta de identificación y polimerasa BST liofilizada. La temperatura permanecerá entre 37 °C y 50 °C para la transcripción inversa. Luego, la muestra se inyecta en la cámara que contiene la exonucleasa I termolábil. A continuación, el bloque calefactor se ajusta a 65 °C durante 5 min para desactivar la enzima. A partir de entonces, las cuatro muestras se juntan y se inyectan en un chip de detección electroquímica debajo de la pluma microfluídica. Cada chip contiene cuatro conjuntos de cebadores y LP con diferentes indicadores electroactivos con potenciales redox no superpuestos para desencadenar la reacción de amplificación en presencia de las secuencias de ID de los participantes respectivos.

La cámara de detección se encuentra sobre una estación de trabajo electroquímica multicanal, que consta de un puerto de conexión entre el sensor electroquímico y el detector, una placa de circuito y una línea de alimentación para la pantalla externa. La placa de circuito se compone principalmente de una unidad de microcontrolador, un convertidor de digital a analógico y un módulo de potenciostato para permitir el análisis de voltametría de pulso diferencial y obtener simultáneamente las señales de una serie de electrodos y, por lo tanto, detectar un total de 100 muestras.

(iv) Para validar el desempeño del prototipo utilizando un espécimen clínico y compararlo con los datos de detección de equipos de prueba disponibles comercialmente.

El método propuesto de prueba de muestras agrupadas se comparará con la prueba estándar de oro RT-PCR en términos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y precisión. Después de demostrar la validez de los resultados obtenidos de la estrategia de combinación propuesta, los investigadores explorarán la posibilidad de utilizar muestras de saliva y gárgaras bucales en lugar de hisopos nasofaríngeos. Los pacientes serán reclutados del Hospital Prince of Wales para la recolección de muestras respiratorias para determinar la precisión de este dispositivo.

A. Procedimientos de estudio

1. Registros médicos de los participantes para recopilar datos clínicos, incluida la edad, el sexo, la cantidad de días después del inicio de los síntomas, la exposición epidemiológica a personas con la enfermedad COVID-19 confirmada, la gravedad (leve, moderada, grave o crítica) y la presencia de Se revisarán las comorbilidades.
2. Se recuperarán los resultados de PCR de SARS-CoV-2 de los participantes del registro electrónico del hospital.
3. Se recolectarán muestras de hisopado nasofaríngeo, saliva de garganta profunda y/o gárgaras bucales de cada paciente reclutado.

B. Procedimientos de laboratorio y análisis de datos

1. Preparación de la muestra Las muestras recolectadas de los 200 pacientes se dividirán primero en dos conjuntos con prevalencia similar, y cada tamaño de muestra es de 100. El primer conjunto de 100 muestras se extraerá mediante el uso de kits comerciales de extracción de ARN viral proporcionados por HKUST, y luego se almacenará para su posterior análisis RT-qPCR y la verificación del método basado en LAMP.
2. Ensayo de RT-qPCR Para preparar el resultado de RT-qPCR como referencia, las muestras extraídas de las mencionadas anteriormente se analizarán mediante RT-qPCR para la detección cualitativa y cuantitativa de ácido nucleico del SARS-CoV-2, y un negativo, un positivo y se debe incluir un experimento de control en blanco. Se registrarán los valores de los umbrales de ciclo (Ct), los resultados cualitativos y cuantitativos de cada muestra. Los procedimientos de RT-qPCR serán seguidos por las pautas recomendadas por los CDC existentes. HKUST proporcionará los conjuntos de cebadores qPCR y sondas Taqman, y la referencia estándar de ARN del SARS-CoV-2.
3. Experimentos de muestras agrupadas El segundo conjunto de 100 muestras inactivadas se dividirá en 25 grupos al azar (cada uno para 4 muestras), y los investigadores realizarán pruebas grupales de SARS-CoV-2 para las 25 agrupaciones utilizando el dispositivo de microfluidos desarrollado anteriormente con investigadores de HKUST. En función de los resultados de la RT-qPCR, HKUST calculará la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo para un análisis de datos adicional.

Conducta del estudio

Este estudio se llevará a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.