Screening della popolazione COVID-19 su larga scala

Le rapide trasmissioni da host a host, unite alla facilità dei viaggi internazionali, hanno portato a epidemie come H5N1, H5N5, SARS e, più recentemente, alla pandemia di COVID-19. Le tradizionali misure di controllo dell'epidemia, come il tracciamento dei contatti e l'isolamento fisico, sono fondamentali per mitigare l'estensione della diffusione della malattia nella fase iniziale della pandemia e queste strategie dipendono dall'accuratezza e dalla velocità della diagnosi dei pazienti sospetti.

Ora il gold standard per il rilevamento dei patogeni è il rilevamento dell'acido nucleico tramite reazione a catena della polimerasi (PCR). Tuttavia, questa strategia è limitata dai tempi di consegna, dalla costosa macchina PCR e dal potenziale numero di infezioni. Pertanto, vengono spesso utilizzati altri metodi di amplificazione isotermica per aggirare la necessità di strumentazione aggiuntiva e accelerare l'intera procedura di rilevamento.

Un approccio per migliorare l'efficienza dello screening delle malattie infettive è il popolare test Dorfman, in cui i campioni vengono raggruppati e testati contemporaneamente per ridurre il numero totale di test eseguiti. Tuttavia, il test di Dorfman è limitato alla popolazione a bassa prevalenza e ha una sensibilità ridotta; È stata inoltre introdotta la strategia del codice a barre per risolvere il test del campione di raggruppamento. Nel 2020, Schmid-Burk e i suoi colleghi hanno combinato LAMP e codici a barre che hanno sviluppato con successo COVID-19 da 100.000 campioni raggruppati. Tuttavia, la necessità di un costoso sequencer di nuova generazione ne limita l'uso diffuso.

Metodi

La piattaforma proposta mira allo sviluppo di un processo a più fasi in un unico dispositivo e alla capacità di identificare la fonte di segnali positivi da campioni raggruppati. Il progetto proposto trarrà vantaggio da una strategia di codici a barre per contrassegnare più fonti di analiti prima del raggruppamento, una combinazione di amplificazione isotermica e rilevamento elettrochimico specifico della sequenza e l'integrazione di diversi passaggi in un semplice dispositivo. La metodologia del progetto di ricerca sarà suddivisa in tre parti.

(i) Sviluppare un metodo di amplificazione isotermica e rilevamento in tempo reale utilizzando sonde oligonucleotidiche ad anello marcate elettroattive

Gli investigatori hanno recentemente concettualizzato un metodo, per il quale gli investigatori hanno depositato una protezione brevettuale provvisoria negli Stati Uniti. Questa nuova tecnica esegue simultaneamente l'amplificazione isotermica e il rilevamento elettrochimico degli ampliconi basati sull'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Lo schema proposto prevede un sistema di amplificazione e rilevamento a un vaso in cui un reporter elettrochimico è attaccato a uno dei primer e viene aggiunto un enzima di intaccatura per scindere il reporter solo quando si verifica l'amplificazione. In una reazione, un DNA stampo è progettato per avere due coppie di siti di legame dei primer: una coppia esterna di primer avanti e indietro (FP e BP) e una coppia interna di primer, vale a dire una sonda ad anello marcata elettrochimicamente (LP) e un sonda assistente (AP). FP e LP si legano allo stesso filamento del modello di DNA a doppio filamento (dsDNA) mentre BP e AP si legano al filamento opposto. L'LP contiene un'etichetta elettroattiva all'estremità 5' e un segmento sporgente 3' complementare alla sequenza del DNA target. La regione staminale contiene la sequenza di riconoscimento di un enzima di intaccatura, ma viene introdotto un disadattamento all'ultimo nucleotide in modo che non venga scisso senza la presenza del DNA bersaglio. L'inizio della reazione è simile alla normale LAMP, può essere prodotto un amplicone a doppio anello e la reazione può entrare nella fase di amplificazione a doppio anello. Ciascuno degli ampliconi a doppio anello può essere considerato come un'unità di amplificazione del segnale. Una volta che l'LP marcato è combinato con l'amplicone e forma un sito di clivaggio che può essere riconosciuto dall'enzima nick, può essere rilasciato un'etichetta elettroattiva e verrà generato un segnale elettrochimico. I risultati preliminari indicano che la strategia è in grado di rilevare fino a 0,1 fg/μL, corrispondenti a circa 10 copie/μL del DNA di input, utilizzando un reporter elettroattivo al blu di metilene su elettrodi di carbonio serigrafati a quattro array (SPCE) all'interno 30 minuti. Le fasi successive includono l'incorporazione di una fase di trascrizione inversa per il rilevamento di campioni di RNA e il test del sistema in matrici complesse per imitare fluidi biologici reali.

(ii) Progettare una strategia molecolare per codificare a barre quattro singoli campioni in modo che possano essere raggruppati insieme e simultaneamente amplificare e identificare l'individuo positivo, se presente, dal campione raggruppato.

Progettando quattro sequenze di codici a barre, i ricercatori sono in grado di costruire prodotti cDNA etichettati attraverso la trascrizione inversa da parte dell'enzima BST. L'esonucleasi I termolabile viene aggiunta per digerire primer di codici a barre a filamento singolo non reagiti. Inoltre, il prodotto duplex cDNA-RNA viene digerito dall'RNasi H per produrre un cDNA a filamento singolo (template ID). La miscela aggregata di template ID viene amplificata attraverso lo stesso processo descritto nella sezione precedente. Solo quei campioni con il virus RNA genereranno segnali elettrochimici positivi.

In questa parte, gli investigatori utilizzeranno l'RNA del virus di sintesi o l'RNA totale del virus estratto commerciale come modello di rilevamento. I campioni addizionati possono essere derisi mescolandoli con saliva umana della gola profonda o tamponi nasofaringei di volontari sani.

(iii) Fabbricare un dispositivo microfluidico per integrare l'elaboratore di campioni e il modulo di codici a barre con l'amplificazione dell'acido nucleico e la fase di rilevamento per lo screening della popolazione su larga scala

In questo progetto, i ricercatori progettano un dispositivo simile a una penna microfluidica semplice e facile da usare che integra le fasi di preparazione del campione, codifica a barre, amplificazione e rilevamento. Utilizza la propulsione a pistoni per fornire potenza per spingere il campione in diverse camere. Innanzitutto, i campioni fittizi vengono aggiunti in una camera di caricamento del campione in cui è conservato il tampone di lisi. Una miscela di surfattina, SDS ed etanolo consente la rapida estrazione dell'acido nucleico virale, che viene quindi iniettato nella camera di identificazione contenente la BST polimerasi liofilizzata e la miscela di primer ID-tag. La temperatura rimarrà a 37 °C-50 °C per la trascrizione inversa. Quindi, il campione viene iniettato nella camera contenente l'esonucleasi I termolabile. Il blocco di riscaldamento viene quindi impostato a 65 ° C per 5 min per disattivare l'enzima. Successivamente, i quattro campioni vengono raggruppati insieme e iniettati in un chip di rilevamento elettrochimico sotto la penna microfluidica. Ogni chip contiene quattro set di primer e LP con diversi reporter elettroattivi con potenziali redox non sovrapposti per innescare la reazione di amplificazione in presenza delle sequenze ID dei rispettivi partecipanti.

La camera di rilevamento si trova in cima a una stazione di lavoro elettrochimica multicanale, costituita da una porta di connessione tra il sensore elettrochimico e il rilevatore, un circuito stampato e una linea elettrica per il display esterno. Il circuito stampato è composto principalmente da un'unità microcontrollore, un convertitore digitale-analogico e un modulo potenziostato per consentire l'analisi della voltammetria dell'impulso differenziale e ottenere contemporaneamente i segnali da una matrice di elettrodi e quindi rilevare un totale di 100 campioni.

(iv) Convalidare le prestazioni del prototipo utilizzando un campione clinico e confrontarlo con i dati di rilevamento delle apparecchiature di test disponibili in commercio.

Il metodo proposto per il test dei campioni raggruppati sarà confrontato con il test RT-PCR gold standard in termini di sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo e accuratezza. Dopo aver dimostrato la validità dei risultati ottenuti dalla strategia di raggruppamento proposta, gli investigatori esploreranno quindi la possibilità di utilizzare campioni di saliva e gargarismi con la bocca al posto dei tamponi nasofaringei. I pazienti saranno reclutati dal Prince of Wales Hospital per la raccolta di campioni respiratori per determinare l'accuratezza di questo dispositivo.

A. Procedure di studio

1. Cartelle cliniche dei partecipanti per raccogliere dati clinici, tra cui età, sesso, numero di giorni dopo l'insorgenza dei sintomi, esposizione epidemiologica a persone con malattia COVID-19 confermata, gravità (lieve, moderata, grave o critica) e presenza di verranno esaminate le comorbidità.
2. Verranno recuperati i risultati della PCR SARS-CoV-2 dei partecipanti dalla cartella clinica elettronica dell'ospedale.
3. Saranno raccolti tampone nasofaringeo, saliva della gola profonda e / o campione di gargarismi della bocca da ciascun paziente reclutato.

B. Procedure di laboratorio e analisi dei dati

1. Preparazione del campione I campioni raccolti dai 200 pazienti saranno in primo luogo divisi per due set con prevalenza simile, e ogni dimensione del campione è 100. I primi 100 campioni verranno estratti utilizzando i kit commerciali di estrazione dell'RNA virale forniti da HKUST e quindi conservati per un'ulteriore analisi RT-qPCR e la verifica del metodo basato su LAMP.
2. Saggio RT-qPCR Per preparare il risultato RT-qPCR come riferimento, i campioni estratti da sopra menzionati saranno analizzati utilizzando RT-qPCR per la rilevazione qualitativa e quantitativa dell'acido nucleico dal SARS-CoV-2 e un negativo, un positivo e dovrebbe essere incluso un esperimento di controllo in bianco. Verranno registrati i valori di soglia del ciclo (Ct), i risultati qualitativi e quantitativi di ciascun campione. Le procedure RT-qPCR saranno seguite dalle linee guida esistenti raccomandate dal CDC. Il primer qPCR e i set di sonde Taqman e il riferimento standard dell'RNA SARS-CoV-2 saranno forniti da HKUST.
3. Esperimenti di campioni in pool Il secondo set di 100 campioni inattivati ​​sarà diviso in 25 gruppi in modo casuale (ciascuno per 4 campioni) e gli investigatori eseguiranno test di gruppo SARS-CoV-2 per i 25 pool utilizzando il dispositivo microfluidico sviluppato sopra con i ricercatori HKUST. Sulla base dei risultati RT-qPCR, la sensibilità, la specificità e i valori predittivi positivi e negativi saranno calcolati per un'ulteriore analisi dei dati da parte di HKUST.

Condotta di studio

Questo studio sarà condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.