Storstilet COVID-19 befolkningsscreening

Hurtige vært-til-vært-transmissioner kombineret med den lette internationale rejser har ført til epidemier som H5N1, H5N5, SARS og senest COVID-19-pandemien. Traditionelle epidemiske kontrolforanstaltninger, såsom kontaktsporing og fysisk isolation, er altafgørende for at afbøde omfanget af sygdomsspredning i det tidlige stadie af pandemien, og disse strategier afhænger af nøjagtigheden og hastigheden af ​​diagnosticering af mistænkte patienter.

Nu er guldstandarden for patogendetektion nukleinsyrepåvisning via polymerasekædereaktion (PCR). Denne strategi er dog begrænset af ekspeditionstid, dyre PCR-maskine og potentielle antal infektioner. Således bruges andre isotermiske amplifikationsmetoder ofte til at omgå behovet for ekstra instrumentering og fremskynde hele detektionsproceduren.

En tilgang til at forbedre effektiviteten af ​​screening af infektionssygdomme er den populære Dorfman-test, hvor prøver samles og testes på samme tid for at reducere det samlede antal udførte tests. Dorfman-testen er dog begrænset til en population med lav prævalens og har reduceret følsomhed; Stregkodningsstrategi er også blevet introduceret for at løse pooling sample test. I 2020 kombinerede Schmid-Burk og hans kolleger LAMP og stregkoder, som med succes udviklede COVID-19 fra 100.000 poolede prøver. Behovet for en dyr næste generations sequencer begrænser imidlertid dens udbredte brug.

Metoder

Den foreslåede platform sigter mod udvikling af en flertrinsproces i én enhed og evnen til at identificere kilden til positive signaler fra poolede prøver. Det foreslåede design vil drage fordel af en stregkodningsstrategi til at mærke flere analytkilder før pooling, en kombination af isotermisk amplifikation og sekvensspecifik elektrokemisk detektion og integration af flere trin i en simpel enhed. Forskningsprojektets metodologi vil blive opdelt i tre dele.

(i) At udvikle en isotermisk amplifikationsmetode og realtidsdetektion ved brug af elektroaktivt mærkede loop oligonukleotidprober

Efterforskerne har for nylig konceptualiseret en metode, som efterforskerne har indgivet en amerikansk foreløbig patentbeskyttelse for. Denne nye teknik udfører isotermisk amplifikation og elektrokemisk detektion af amplikoner samtidigt baseret på Loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP). Det foreslåede skema involverer et one-pot amplifikations- og detektionssystem, hvor en elektrokemisk reporter er knyttet til en af ​​primerne, og et nicking-enzym tilsættes for kun at spalte reporteren, når amplifikation finder sted. I en reaktion er et template-DNA designet til at have to par primerbindingssteder: et ydre par fremad- og bagudgående primere (FP og BP) og et indre par primere, nemlig en elektrokemisk mærket loop-probe (LP) og en assistentsonde (AP). FP og LP binder til den samme streng af den dobbeltstrengede DNA (dsDNA) skabelon, mens BP og AP binder til den modsatte streng. LP'en indeholder et elektroaktivt mærke ved 5'-enden og et 3'-overhængende segment komplementært til mål-DNA-sekvensen. Stammeregionen indeholder genkendelsessekvensen af ​​et nicking-enzym, men der indføres en mismatch til det sidste nukleotid, så det ikke spaltes uden tilstedeværelsen af ​​mål-DNA'et. Starten af ​​reaktionen ligner almindelig LAMP, der kan fremstilles et dobbelt-loop-amplikon, og reaktionen kan komme i dobbelt-loop-amplifikationsstadiet. Hver af dobbeltsløjfe-amplikonerne kan betragtes som en signalforstærkningsenhed. Når det mærkede LP er kombineret med amplikonet og danner et spaltningssted, der kan genkendes af nick-enzymet, kan et elektroaktivt mærke frigives, og et elektrokemisk signal vil blive genereret. De foreløbige resultater indikerer, at strategien er i stand til at detektere op til 0,1 fg/μL, svarende til omkring 10 kopier/μL af input-DNA'et, ved at bruge en methylenblå elektroaktiv reporter på fire-array screen-printede carbonelektroder (SPCE'er) inden for 30 min. De efterfølgende trin inkluderer inkorporering af et omvendt transkriptionstrin til påvisning af RNA-prøver og test af systemet i komplekse matricer for at efterligne faktiske biologiske væsker.

(ii) At designe en molekylær strategi til at stregkode fire individuelle prøver, så de kan pooles sammen og samtidig amplificere og identificere det positive individ, hvis nogen, fra den poolede prøve.

Ved at designe fire stregkodesekvenser er efterforskerne i stand til at konstruere mærkede cDNA-produkter gennem omvendt transkription med BST-enzym. Termolabil exonuklease I tilsættes for at fordøje uomsatte enkeltstrengs stregkodeprimere. Derudover fordøjes cDNA-RNA-dupleksproduktet af RNase H for at give et enkeltstrenget cDNA (ID-skabelon). Den samlede blanding af ID-skabeloner amplificeres gennem den samme proces som beskrevet i det foregående afsnit. Kun de prøver med RNA-virus vil generere positive elektrokemiske signaler.

I denne del vil efterforskerne bruge syntesevirus-RNA eller kommercielt ekstraheret virus-total-RNA som detektionsskabelon. De spidsede prøver kan spottes ved at blande dem med menneskeligt dybt halsspyt eller nasopharyngeale podninger fra raske frivillige.

(iii) At fremstille en mikrofluidisk enhed til at integrere prøveprocessoren og stregkodningsmodulet med nukleinsyreamplifikations- og detektionstrinnet til storskala populationsscreening

I dette projekt designer efterforskerne en enkel og letanvendelig mikrofluidisk pen-lignende enhed, der integrerer trinene til prøveforberedelse, stregkodning og amplifikation og detektion. Den bruger stempelfremdrift til at give strøm til at skubbe prøven ind i forskellige kamre. Først tilføjes de falske prøver til et prøvepåfyldningskammer, hvor lyseringsbufferen opbevares. En blanding af surfactin, SDS og ethanol muliggør hurtig ekstraktion af viral nukleinsyre, som derefter injiceres ned til identifikationskammeret indeholdende den frysetørrede BST-polymerase og ID-tag-primerblanding. Temperaturen forbliver på 37 °C-50 °C for omvendt transkription. Derefter injiceres prøven i kammeret, der indeholder termolabil exonuklease I. Varmeblokken indstilles derefter til 65 °C i 5 minutter for at deaktivere enzymet. Derefter samles de fire prøver og injiceres i en elektrokemisk detektionschip under den mikrofluidiske pen. Hver chip indeholder fire sæt primere og LP'er med forskellige elektroaktive reportere med ikke-overlappende redoxpotentialer for at udløse amplifikationsreaktionen i nærværelse af respektive deltagers ID-sekvenser.

Detektionskammeret sidder oven på en flerkanals elektrokemisk arbejdsstation, som består af en forbindelsesport mellem den elektrokemiske sensor og detektor, et printkort og en strømledning til ekstern skærm. Kredsløbskortet består hovedsageligt af en mikrocontrollerenhed, en digital-til-analog konverter og et potentiostatmodul for at muliggøre differentiel pulsvoltammetrianalyse og samtidig opnå signalerne fra et array af elektroder og derved detektere i alt 100 prøver.

(iv) At validere prototypens ydeevne ved hjælp af en klinisk prøve og benchmarke den mod detektionsdata fra kommercielt tilgængeligt testudstyr.

Den foreslåede metode til puljetestning vil blive sammenlignet med guldstandard RT-PCR-testen med hensyn til sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi, negativ prædiktiv værdi og nøjagtighed. Efter at have demonstreret validiteten af ​​resultaterne opnået fra den foreslåede poolingstrategi, vil efterforskerne derefter undersøge muligheden for at bruge spyt- og mundgurgleprøver i stedet for nasopharyngeale podninger. Patienter vil blive rekrutteret fra Prince of Wales Hospital til indsamling af respiratoriske prøver for at bestemme nøjagtigheden af ​​denne enhed.

A. Undersøgelsesprocedurer

1. Deltagernes lægejournaler til indsamling af kliniske data, herunder alder, køn, antal dage efter symptomernes begyndelse, epidemiologisk eksponering for personer med bekræftet COVID-19-sygdom, sværhedsgrad (mild, moderat, svær eller kritisk) og tilstedeværelsen af komorbiditeter vil blive gennemgået.
2. SARS-CoV-2 PCR-resultater fra deltagerne fra hospitalets elektroniske journal vil blive hentet.
3. Nasopharyngeal podning, dyb halsspyt og/eller mundgurgleprøve fra hver rekrutteret patient vil blive indsamlet.

B. Laboratorieprocedurer og dataanalyser

1. Prøveforberedelse Prøverne indsamlet fra de 200 patienter vil først blive opdelt i to sæt med lignende prævalens, og hver prøvestørrelse er 100. Det første sæt 100 prøver vil blive ekstraheret ved at bruge kommercielle virale RNA-ekstraktionssæt leveret af HKUST og derefter blive opbevaret til yderligere RT-qPCR-analyse og den LAMP-baserede metodeverifikation.
2. RT-qPCR-assay For at forberede RT-qPCR-resultatet som reference, vil de ekstraherede prøver fra nævnt ovenfor blive analyseret ved hjælp af RT-qPCR til kvalitativ og kvantitativ påvisning af nukleinsyre fra SARS-CoV-2, og en negativ, en positiv og et blankt kontroleksperiment bør inkluderes. Cyklustærskelværdierne (Ct), kvalitative og kvantitative resultater for hver prøve vil blive registreret. RT-qPCR-procedurerne vil blive fulgt af eksisterende CDC-anbefalede retningslinjer. qPCR-primeren og Taqman-probesættene og SARS-CoV-2 RNA-standardreference vil blive leveret af HKUST.
3. Poolede prøveeksperimenter Det andet sæt 100 inaktiverede prøver vil blive opdelt i 25 grupper tilfældigt (hver for 4 prøver), og efterforskerne vil udføre SARS-CoV-2 gruppetestning for de 25 puljer ved hjælp af den mikrofluidiske enhed udviklet ovenfor med HKUST-forskere. Baseret på RT-qPCR-resultaterne vil sensitivitet, specificitet og positive og negative prædiktive værdier blive beregnet til yderligere dataanalyse af HKUST.

Studieadfærd

Denne undersøgelse vil blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.