Nagyszabású COVID-19 népességszűrés

A gyors, gazdaszervezetek közötti átvitel és a könnyű nemzetközi utazás olyan járványokhoz vezetett, mint a H5N1, H5N5, SARS, és legutóbb a COVID-19 világjárvány. A hagyományos járványvédelmi intézkedések, mint például az érintkezés nyomon követése és a fizikai izolálás, rendkívül fontosak a járvány terjedésének mérséklésében a járvány korai szakaszában, és ezek a stratégiák a gyanús betegek diagnosztizálásának pontosságától és sebességétől függenek.

Manapság a kórokozók kimutatásának arany standardja a nukleinsav kimutatás polimeráz láncreakcióval (PCR). Ezt a stratégiát azonban korlátozza az átfutási idő, a drága PCR-gép és a lehetséges fertőzések száma. Így gyakran más izoterm amplifikációs módszereket is alkalmaznak, hogy megkerüljék az extra műszerezés szükségességét és felgyorsítsák a teljes detektálási eljárást.

A fertőző betegségek szűrésének hatékonyságának javításának egyik módja a népszerű Dorfman-teszt, ahol a mintákat egyesítik, és egyidejűleg tesztelik, hogy csökkentsék az elvégzett tesztek számát. A Dorfman-teszt azonban az alacsony prevalenciájú populációra korlátozódik, és csökkent az érzékenysége; Vonalkódolási stratégiát is bevezettek a pooling minta teszt megoldására. 2020-ban Schmid-Burk és munkatársai egyesítették a LAMP-t és a vonalkódolást, amely sikeresen fejlesztette ki a COVID-19-et 100 000 egyesített mintából. A drága következő generációs szekvenszer iránti igény azonban korlátozza széles körű használatát.

Mód

A javasolt platform célja egy többlépcsős folyamat egy eszközben történő kifejlesztése, valamint az összesített mintákból származó pozitív jelek forrásának azonosítása. A javasolt terv kihasználja a vonalkódolási stratégiát, amellyel több analitikai forrást megjelölhet az összevonás előtt, az izoterm amplifikáció és a szekvencia-specifikus elektrokémiai detektálás kombinációját, valamint több lépés egyetlen egyszerű eszközbe történő integrálását. A kutatási projekt módszertana három részre oszlik.

(i) Izoterm amplifikációs módszer és valós idejű detektálás kidolgozása elektroaktívan jelölt hurokoligonukleotid próbák segítségével

A nyomozók a közelmúltban konceptualizáltak egy módszert, amelyre a nyomozók ideiglenes szabadalmi oltalmat nyújtottak be az Egyesült Államokban. Ez az új technika egyszerre hajtja végre az amplikonok izoterm erősítését és elektrokémiai detektálását a hurok által közvetített izoterm amplifikáció (LAMP) alapján. A javasolt séma egy egyedényes amplifikációs és kimutatási rendszert foglal magában, amelyben egy elektrokémiai riportert kapcsolnak az egyik primerhez, és egy nicking enzimet adnak hozzá, hogy a riportert csak amplifikáció esetén hasítsák el. Az egyik reakcióban a templát DNS-t úgy tervezték meg, hogy két pár primer kötőhely legyen: egy külső pár előre és hátra primer (FP és BP) és egy belső primerpár, nevezetesen egy elektrokémiailag jelölt hurokpróba (LP) és egy asszisztens szonda (AP). Az FP és LP a kettős szálú DNS (dsDNS) templát azonos szálához, míg a BP és AP az ellenkező szálhoz kötődik. Az LP elektroaktív jelölést tartalmaz az 5' végén és egy 3' túlnyúló szegmenst, amely komplementer a cél DNS-szekvenciával. A szárrégió tartalmazza egy nicking enzim felismerési szekvenciáját, de az utolsó nukleotidhoz hibás illeszkedést vezetnek be, így az nem hasad fel a cél-DNS jelenléte nélkül. A reakció kezdete hasonló a közönséges LAMP-hoz, kéthurkos amplikon állítható elő, és a reakció a kettős hurkos amplifikációs szakaszba kerülhet. Mindegyik kéthurkos amplikon jelerősítő egységnek tekinthető. Miután a jelölt LP egyesül az amplikonnal, és olyan hasítási helyet képez, amelyet a nick enzim felismerhet, egy elektroaktív jelölés szabadulhat fel, és elektrokémiai jel keletkezik. Az előzetes eredmények azt mutatják, hogy a stratégia akár 0,1 fg/μL-t is képes kimutatni, ami körülbelül 10 kópia/μl bemeneti DNS-nek felel meg, ha metilénkék elektroaktív riportert használunk négy-array szitanyomott szénelektródákon (SPCE) belül. 30 perc. A következő lépések közé tartozik egy reverz transzkripciós lépés beépítése az RNS-minták kimutatására, és a rendszer tesztelése komplex mátrixokban, hogy utánozzák a tényleges biológiai folyadékokat.

(ii) Molekuláris stratégia megtervezése négy egyedi minta vonalkódolására, hogy azokat össze lehessen vonni, és egyidejűleg amplifikálják és azonosítsák a pozitív egyedet, ha van ilyen, az egyesített mintából.

Négy vonalkód-szekvencia megtervezésével a kutatók képesek megjelölt cDNS-termékeket létrehozni a BST enzim reverz transzkripciójával. A termolabilis exonukleáz I-et a nem reagált egyszálú vonalkód-primerek emésztésére adjuk hozzá. Ezenkívül a cDNS-RNS duplex terméket RNáz H-val emésztjük, hogy egyszálú cDNS-t (ID-templát) kapjunk. Az ID-templátok egyesített keverékét az előző részben leírt eljárással amplifikáljuk. Csak az RNS-vírust tartalmazó minták generálnak pozitív elektrokémiai jeleket.

Ebben a részben a kutatók szintetizáló vírus RNS-t vagy a kereskedelemben extrahált vírus teljes RNS-t használnak kimutatási templátként. A tüskés mintákat meg lehet gúnyolni, ha emberi mélytorok nyállal vagy egészséges önkéntesektől származó nasopharyngeális tamponnal keverik.

(iii) Mikrofluidikus eszköz gyártása a mintaprocesszor és a vonalkódoló modul integrálására a nukleinsav-amplifikációs és kimutatási lépéssel a nagyszabású populációs szűréshez

Ebben a projektben a kutatók egy egyszerű és könnyen használható mikrofluidikus tollszerű eszközt terveznek, amely integrálja a minta-előkészítés, a vonalkódolás, valamint az amplifikáció és detektálás lépéseit. Dugattyús meghajtást használ, hogy energiát biztosítson a minta különböző kamrákba való betolásához. Először a próbamintákat egy mintatöltő kamrába adják, ahol a lízispuffert tárolják. A surfaktin, SDS és etanol keveréke lehetővé teszi a vírus nukleinsav gyors extrakcióját, amelyet azután a fagyasztva szárított BST polimerázt és az ID-tag primer keveréket tartalmazó azonosító kamrába fecskendeznek. A hőmérséklet 37 °C-50 °C marad a reverz transzkripcióhoz. Ezután a mintát befecskendezik a termolabilis exonukleáz I-et tartalmazó kamrába. A fűtőblokkot ezután 65 °C-ra állítjuk 5 percre az enzim inaktiválásához. Ezt követően a négy mintát egyesítik, és egy elektrokémiai detektáló chipbe fecskendezik a mikrofluidikus toll alatt. Mindegyik chip négy primer- és LP-készletet tartalmaz különböző elektroaktív riporterekkel, amelyek nem átfedő redoxpotenciállal rendelkeznek, hogy kiváltsák az amplifikációs reakciót a megfelelő résztvevő ID szekvenciáinak jelenlétében.

Az észlelőkamra egy többcsatornás elektrokémiai munkaállomás tetején található, amely az elektrokémiai érzékelő és a detektor közötti csatlakozási portból, egy áramköri lapból és a külső kijelző tápvezetékéből áll. Az áramköri kártya főként egy mikrokontroller egységből, egy digitális-analóg átalakítóból és egy potenciosztát modulból áll, amely lehetővé teszi a differenciális impulzus voltammetriás elemzést, és egyidejűleg elektródák jeleinek vételét, és ezáltal összesen 100 mintát.

(iv) A prototípus teljesítményének validálása klinikai minta segítségével, és összehasonlítása a kereskedelemben kapható vizsgálóberendezések kimutatási adataival.

Az egyesített minták tesztelésének javasolt módszerét az érzékenység, a specificitás, a pozitív prediktív érték, a negatív prediktív érték és a pontosság tekintetében összehasonlítják az arany standard RT-PCR teszttel. Miután bemutatták a javasolt összevonási stratégiával kapott eredmények érvényességét, a kutatók megvizsgálják annak lehetőségét, hogy a nasopharyngealis tamponok helyett nyál- és szájüregi gargalizálási mintákat alkalmazzanak. A betegeket a Prince of Wales Kórházból toborozzák a légúti minták gyűjtése céljából, hogy meghatározzák az eszköz pontosságát.

A. Tanulmányi eljárások

1. A résztvevők orvosi feljegyzései a klinikai adatok gyűjtéséhez, beleértve az életkort, nemet, a tünetek megjelenését követő napok számát, a COVID-19 igazolt betegségben szenvedő betegek epidemiológiai expozícióját, súlyosságát (enyhe, közepes, súlyos vagy kritikus) és a társbetegségeket felülvizsgálják.
2. A résztvevők SARS-CoV-2 PCR eredményeit a kórházi elektronikus nyilvántartásból lekérjük.
3. Minden egyes felvett pácienstől orrgarat-tamponot, mélytorok-nyálat és/vagy szájgargalizáló mintát vesznek.

B. Laboratóriumi eljárások és adatelemzések

1. Minta-előkészítés A 200 betegtől gyűjtött mintákat először két hasonló gyakoriságú csoportra osztjuk, és mindegyik mintaméret 100. Az első 100 mintát a HKUST által biztosított, kereskedelmi forgalomban lévő vírus RNS extrakciós kitekkel extraháljuk, majd tároljuk további RT-qPCR elemzéshez és a LAMP-alapú módszer ellenőrzéséhez.
2. RT-qPCR vizsgálat Az RT-qPCR eredmény referenciaként való elkészítéséhez a fent említett mintákból kivont mintákat RT-qPCR segítségével elemzik a SARS-CoV-2 nukleinsav kvalitatív és kvantitatív kimutatására, és egy negatív, pozitív eredményt. és egy vak kontrollkísérletet is be kell vonni. A ciklus küszöbértékeit (Ct), valamint az egyes minták minőségi és mennyiségi eredményeit rögzítik. Az RT-qPCR eljárásokat a meglévő CDC által javasolt irányelvek követik. A qPCR primert és a Taqman próbakészleteket, valamint a SARS-CoV-2 RNS standard referenciát a HKUST biztosítja.
3. Összevont mintakísérletek A második készlet 100 inaktivált mintát véletlenszerűen 25 csoportra osztják (mindegyik 4 mintát), és a vizsgálók SARS-CoV-2 csoportos vizsgálatot végeznek a 25 mintában a HKUST kutatóival fentebb kifejlesztett mikrofluidikus eszköz segítségével. Az RT-qPCR eredmények alapján az érzékenységet, specificitást, valamint pozitív és negatív prediktív értékeket kiszámítja a HKUST további adatelemzése céljából.

Tanulmányi magatartás

Ezt a tanulmányt a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezzük.