Масштабный скрининг населения на COVID-19

Быстрая передача от хозяина к хозяину в сочетании с простотой международных поездок привела к таким эпидемиям, как H5N1, H5N5, SARS и, совсем недавно, к пандемии COVID-19. Традиционные меры борьбы с эпидемией, такие как отслеживание контактов и физическая изоляция, имеют первостепенное значение для снижения масштабов распространения болезни на ранней стадии пандемии, и эти стратегии зависят от точности и скорости диагностики подозреваемых пациентов.

В настоящее время золотым стандартом обнаружения патогенов является обнаружение нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако эта стратегия ограничена временем обработки, дорогой машиной для ПЦР и потенциальным количеством инфекций. Таким образом, часто используются другие методы изотермической амплификации, чтобы обойти необходимость в дополнительных приборах и ускорить всю процедуру обнаружения.

Одним из подходов к повышению эффективности скрининга инфекционных заболеваний является популярный тест Дорфмана, при котором образцы объединяются и тестируются одновременно, чтобы сократить общее количество выполняемых тестов. Однако тест Дорфмана ограничен популяцией с низкой распространенностью и имеет пониженную чувствительность; Стратегия штрих-кодирования также была введена для решения теста на объединение образцов. В 2020 году Шмид-Бурк и его коллеги объединили LAMP и штрих-кодирование, которые успешно выявили COVID-19 из 100 000 объединенных образцов. Однако потребность в дорогом секвенсоре следующего поколения ограничивает его широкое применение.

Методы

Предлагаемая платформа направлена ​​на разработку многоэтапного процесса в одном устройстве и возможность идентификации источника положительных сигналов из объединенных образцов. Предлагаемый дизайн будет использовать преимущества стратегии штрихового кодирования для маркировки нескольких источников аналитов перед объединением, комбинацию изотермической амплификации и электрохимического обнаружения с учетом последовательности, а также интеграцию нескольких этапов в одном простом устройстве. Методология исследовательского проекта будет разделена на три части.

(i) Разработать метод изотермической амплификации и детекцию в реальном времени с использованием электроактивно меченных петлевых олигонуклеотидных зондов.

Исследователи недавно концептуализировали метод, для которого исследователи подали заявку на предварительную патентную защиту США. Этот новый метод одновременно выполняет изотермическую амплификацию и электрохимическое обнаружение ампликонов на основе петлевой изотермической амплификации (LAMP). Предложенная схема включает однореакторную систему амплификации и детекции, в которой электрохимический репортер присоединяется к одному из праймеров, а фермент, делающий разрыв, добавляется для расщепления репортера только тогда, когда происходит амплификация. В одной реакции матричная ДНК имеет две пары сайтов связывания праймеров: внешнюю пару прямых и обратных праймеров (FP и BP) и внутреннюю пару праймеров, а именно электрохимически меченый петлевой зонд (LP) и вспомогательный зонд (AP). FP и LP связываются с одной и той же цепью матрицы двухцепочечной ДНК (дцДНК), тогда как BP и AP связываются с противоположной цепью. LP содержит электроактивную метку на 5'-конце и выступающий 3'-сегмент, комплементарный последовательности ДНК-мишени. Стволовая область содержит последовательность узнавания фермента, создающего разрывы, но в последний нуклеотид вводится несоответствие, так что он не будет расщеплен без присутствия ДНК-мишени. Начало реакции аналогично обычному LAMP, может быть получен ампликон с двойной петлей, и реакция может перейти в стадию амплификации с двойной петлей. Каждый из двухконтурных ампликонов можно рассматривать как блок усиления сигнала. Как только меченый LP объединяется с ампликоном и образует сайт расщепления, который может быть распознан ник-ферментом, может высвобождаться электроактивная метка, и будет генерироваться электрохимический сигнал. Предварительные результаты показывают, что эта стратегия способна обнаруживать до 0,1 фг/мкл, что соответствует примерно 10 копиям/мкл вводимой ДНК, с использованием электроактивного репортера метиленового синего на угольных электродах с трафаретной печатью (SPCE) с четырьмя матрицами в течение 30 минут. Последующие шаги включают в себя включение этапа обратной транскрипции для обнаружения образцов РНК и тестирования системы в сложных матрицах для имитации реальных биологических жидкостей.

(ii) Разработать молекулярную стратегию для штрих-кодирования четырех отдельных образцов, чтобы их можно было объединить вместе и одновременно амплифицировать и идентифицировать положительный индивидуум, если таковой имеется, из объединенного образца.

Разработав четыре последовательности штрих-кода, исследователи могут создавать меченые продукты кДНК посредством обратной транскрипции с помощью фермента BST. Термолабильная экзонуклеаза I добавляется для расщепления непрореагировавших одноцепочечных праймеров штрих-кода. Кроме того, продукт дуплекса кДНК-РНК расщепляется РНКазой Н с получением одноцепочечной кДНК (ID-матрицы). Объединенная смесь ID-матриц амплифицируется с помощью того же процесса, который описан в предыдущем разделе. Только образцы с РНК-вирусом будут генерировать положительные электрохимические сигналы.

В этой части исследователи будут использовать синтезированную РНК вируса или общую вирусную РНК, извлеченную из коммерческих источников, в качестве шаблона для обнаружения. Образцы с шипами можно имитировать, смешивая со слюной человека из глубокой глотки или мазками из носоглотки здоровых добровольцев.

(iii) Изготовление микрожидкостного устройства для интеграции процессора образцов и модуля штрих-кодирования с этапом амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот для крупномасштабного скрининга населения.

В этом проекте исследователи разрабатывают простое и удобное в использовании микрофлюидное устройство, похожее на ручку, которое объединяет этапы подготовки образцов, штрих-кодирования, амплификации и обнаружения. Он использует поршневой двигатель, чтобы обеспечить мощность для подачи образца в разные камеры. Во-первых, имитационные образцы добавляются в камеру для загрузки образцов, где хранится буфер для лизиса. Смесь сурфактина, SDS и этанола позволяет быстро выделить вирусную нуклеиновую кислоту, которую затем вводят в идентификационную камеру, содержащую лиофилизированную полимеразу BST и смесь праймеров для ID-метки. Температура будет оставаться на уровне 37 ° C-50 ° C для обратной транскрипции. Затем образец вводят в камеру, содержащую термолабильную экзонуклеазу I. Затем нагревательный блок устанавливают на 65°С на 5 мин для деактивации фермента. После этого четыре образца объединяются и вводятся в чип для электрохимического обнаружения под микрофлюидной ручкой. Каждый чип содержит четыре набора праймеров и LP с различными электроактивными репортерами с неперекрывающимися окислительно-восстановительными потенциалами для запуска реакции амплификации в присутствии последовательностей ID соответствующего участника.

Камера обнаружения находится на многоканальной электрохимической рабочей станции, которая состоит из соединительного порта между электрохимическим датчиком и детектором, печатной платы и линии питания для внешнего дисплея. Печатная плата в основном состоит из блока микроконтроллера, цифро-аналогового преобразователя и модуля потенциостата, что позволяет проводить анализ дифференциальной импульсной вольтамперометрии и одновременно получать сигналы от массива электродов и, таким образом, обнаруживать в общей сложности 100 образцов.

(iv) Подтвердить эффективность прототипа с использованием клинического образца и сравнить его с данными обнаружения, полученными с помощью коммерчески доступного испытательного оборудования.

Предлагаемый метод тестирования объединенных образцов будет сравниваться с золотым стандартом теста ОТ-ПЦР с точки зрения чувствительности, специфичности, положительной прогностической ценности, отрицательной прогностической ценности и точности. После демонстрации достоверности результатов, полученных с помощью предложенной стратегии объединения, исследователи изучат возможность использования образцов слюны и полоскания рта вместо мазков из носоглотки. Пациенты будут набраны из больницы принца Уэльского для сбора образцов из дыхательных путей, чтобы определить точность этого устройства.

А. Процедуры исследования

1. Медицинские записи участников для сбора клинических данных, включая возраст, пол, количество дней после появления симптомов, эпидемиологическое воздействие людей с подтвержденным заболеванием COVID-19, степень тяжести (легкая, умеренная, тяжелая или критическая) и наличие сопутствующие заболевания будут рассмотрены.
2. Результаты ПЦР SARS-CoV-2 участников будут извлечены из электронной записи больницы.
3. Образцы мазка из носоглотки, слюны из глубокого зева и/или полоскания рта будут взяты у каждого набранного пациента.

B. Лабораторные процедуры и анализ данных

1. Подготовка образцов Образцы, взятые у 200 пациентов, сначала будут разделены на две группы с одинаковой распространенностью, и размер каждой выборки будет равен 100. Первый набор из 100 образцов будет извлечен с использованием коммерческих наборов для выделения вирусной РНК, предоставленных HKUST, а затем сохранен для дальнейшего анализа RT-qPCR и проверки метода на основе LAMP.
2. Анализ RT-qPCR Чтобы подготовить результат RT-qPCR в качестве эталона, извлеченные образцы из упомянутых выше будут проанализированы с использованием RT-qPCR для качественного и количественного обнаружения нуклеиновой кислоты из SARS-CoV-2, а также отрицательных и положительных результатов. и должен быть включен пустой контрольный эксперимент. Значения порогов цикла (Ct), качественные и количественные результаты каждого образца будут записаны. Процедуры RT-qPCR будут сопровождаться существующими рекомендациями CDC. Наборы праймеров для кПЦР и зондов Taqman, а также стандартный эталон РНК SARS-CoV-2 будут предоставлены HKUST.
3. Эксперименты с объединенными образцами Второй набор из 100 инактивированных образцов будет случайным образом разделен на 25 групп (каждая по 4 образца), и исследователи проведут групповое тестирование SARS-CoV-2 для 25 пулов с использованием микрожидкостного устройства, разработанного выше совместно с исследователями HKUST. На основании результатов RT-qPCR будут рассчитаны чувствительность, специфичность, а также положительные и отрицательные прогностические значения для дальнейшего анализа данных с помощью HKUST.

Проведение исследования

Это исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией.