Groß angelegtes COVID-19-Bevölkerungs-Screening

Schnelle Host-to-Host-Übertragungen in Verbindung mit der Leichtigkeit des internationalen Reisens haben zu Epidemien wie H5N1, H5N5, SARS und zuletzt der COVID-19-Pandemie geführt. Herkömmliche Maßnahmen zur Seuchenbekämpfung wie Kontaktverfolgung und physische Isolation sind von größter Bedeutung, um das Ausmaß der Ausbreitung der Krankheit im Frühstadium der Pandemie einzudämmen, und diese Strategien hängen von der Genauigkeit und Geschwindigkeit der Diagnose verdächtiger Patienten ab.

Der Goldstandard für den Erregernachweis ist heute der Nukleinsäurenachweis mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Diese Strategie ist jedoch durch die Durchlaufzeit, die teure PCR-Maschine und die potenzielle Anzahl von Infektionen begrenzt. Daher werden häufig andere isotherme Amplifikationsverfahren verwendet, um die Notwendigkeit einer zusätzlichen Instrumentierung zu umgehen und das gesamte Nachweisverfahren zu beschleunigen.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Screening-Effizienz von Infektionskrankheiten ist der beliebte Dorfman-Test, bei dem Proben gepoolt und gleichzeitig getestet werden, um die Gesamtzahl der durchgeführten Tests zu reduzieren. Der Dorfman-Test ist jedoch auf Populationen mit niedriger Prävalenz beschränkt und hat eine reduzierte Sensitivität; Es wurde auch eine Barcode-Strategie eingeführt, um den Pooling-Probentest zu lösen. Im Jahr 2020 kombinierten Schmid-Burk und seine Kollegen LAMP und Barcodes, wodurch COVID-19 aus 100.000 gepoolten Proben erfolgreich entwickelt wurde. Die Notwendigkeit eines teuren Sequenzers der nächsten Generation schränkt jedoch seine weit verbreitete Verwendung ein.

Methoden

Die vorgeschlagene Plattform zielt auf die Entwicklung eines mehrstufigen Prozesses in einem Gerät und die Fähigkeit ab, die Quelle positiver Signale aus gepoolten Proben zu identifizieren. Das vorgeschlagene Design nutzt eine Barcode-Strategie zur Markierung mehrerer Analytquellen vor dem Pooling, eine Kombination aus isothermer Amplifikation und sequenzspezifischer elektrochemischer Detektion sowie die Integration mehrerer Schritte in einem einfachen Gerät. Die Methodik des Forschungsprojekts wird in drei Teile gegliedert.

(i) Entwicklung eines isothermen Amplifikationsverfahrens und eines Echtzeitnachweises unter Verwendung von elektroaktiv markierten Loop-Oligonukleotidsonden

Die Ermittler haben kürzlich ein Verfahren konzipiert, für das die Ermittler einen vorläufigen US-Patentschutz beantragt haben. Diese neue Technik führt die isotherme Amplifikation und den elektrochemischen Nachweis von Amplikons gleichzeitig durch, basierend auf Loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Das vorgeschlagene Schema umfasst ein Eintopf-Amplifikations- und Nachweissystem, bei dem ein elektrochemischer Reporter an einen der Primer gebunden wird und ein Nicking-Enzym hinzugefügt wird, um den Reporter nur dann zu spalten, wenn eine Amplifikation auftritt. In einer Reaktion wird eine Matrizen-DNA so gestaltet, dass sie zwei Paare von Primerbindungsstellen aufweist: ein äußeres Paar von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (FP und BP) und ein inneres Paar von Primern, nämlich eine elektrochemisch markierte Schleifensonde (LP) und eine Hilfssonde (AP). FP und LP binden an denselben Strang der doppelsträngigen DNA (dsDNA)-Matrize, während BP und AP an den gegenüberliegenden Strang binden. Das LP enthält eine elektroaktive Markierung am 5'-Ende und ein 3'-überhängendes Segment, das komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist. Die Stammregion enthält die Erkennungssequenz eines Nicking-Enzyms, aber eine Fehlpaarung wird in das letzte Nukleotid eingeführt, so dass es ohne die Anwesenheit der Ziel-DNA nicht gespalten wird. Der Start der Reaktion ist ähnlich wie bei gewöhnlichem LAMP, ein Doppelschleifen-Amplikon kann hergestellt werden und die Reaktion kann in die Doppelschleifen-Amplifikationsstufe eintreten. Jeder der Doppelschleifenverstärker kann als Signalverstärkungseinheit betrachtet werden. Sobald das markierte LP mit dem Amplikon kombiniert ist und eine Spaltstelle bildet, die vom Nick-Enzym erkannt werden kann, kann eine elektroaktive Markierung freigesetzt werden und ein elektrochemisches Signal wird erzeugt. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass die Strategie in der Lage ist, bis zu 0,1 fg/μl nachzuweisen, was etwa 10 Kopien/μl der Eingabe-DNA entspricht, indem ein elektroaktiver Methylenblau-Reporter auf siebgedruckten Kohlenstoffelektroden (SPCEs) mit vier Arrays verwendet wird 30 Minuten. Die nachfolgenden Schritte umfassen das Einfügen eines reversen Transkriptionsschritts zum Nachweis von RNA-Proben und das Testen des Systems in komplexen Matrizen, um tatsächliche biologische Flüssigkeiten nachzuahmen.

(ii) Um eine molekulare Strategie zu entwerfen, um vier einzelne Proben mit einem Strichcode zu versehen, damit sie zusammengepoolt werden können, und um gleichzeitig das positive Individuum, falls vorhanden, aus der gepoolten Probe zu amplifizieren und zu identifizieren.

Durch das Entwerfen von vier Barcode-Sequenzen sind die Forscher in der Lage, markierte cDNA-Produkte durch reverse Transkription durch das BST-Enzym zu konstruieren. Thermolabile Exonuklease I wird hinzugefügt, um nicht umgesetzte Einzelstrang-Barcode-Primer zu verdauen. Darüber hinaus wird das cDNA-RNA-Duplexprodukt durch RNase H verdaut, um eine einzelsträngige cDNA (ID-Matrize) zu ergeben. Die gepoolte Mischung von ID-Matrizen wird durch denselben Prozess amplifiziert, der im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde. Nur die Proben mit dem RNA-Virus erzeugen positive elektrochemische Signale.

In diesem Teil verwenden die Ermittler synthetisierte Virus-RNA oder kommerziell extrahierte Virus-Gesamt-RNA als Nachweisvorlage. Die dotierten Proben können durch Mischen mit menschlichem Rachenspeichel oder Nasen-Rachen-Abstrichen von gesunden Probanden verspottet werden.

(iii) Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Integration des Probenprozessors und des Barcode-Moduls mit dem Nukleinsäure-Amplifikations- und -Detektionsschritt für ein Populations-Screening im großen Maßstab

In diesem Projekt entwerfen die Forscher ein einfaches und benutzerfreundliches mikrofluidisches stiftähnliches Gerät, das die Schritte der Probenvorbereitung, der Strichcodierung sowie der Amplifikation und Detektion integriert. Es verwendet einen Kolbenantrieb, um Kraft bereitzustellen, um die Probe in verschiedene Kammern zu drücken. Zunächst werden die Scheinproben in eine Probenladekammer gegeben, in der der Lysepuffer gelagert wird. Eine Mischung aus Surfactin, SDS und Ethanol ermöglicht die schnelle Extraktion viraler Nukleinsäure, die dann in die Identifikationskammer injiziert wird, die die gefriergetrocknete BST-Polymerase und die ID-Tag-Primer-Mischung enthält. Die Temperatur wird für die reverse Transkription bei 37°C–50°C bleiben. Dann wird die Probe in die Kammer injiziert, die die thermolabile Exonuklease I enthält. Der Heizblock wird dann für 5 min auf 65 °C eingestellt, um das Enzym zu deaktivieren. Danach werden die vier Proben gepoolt und in einen elektrochemischen Detektionschip unterhalb des mikrofluidischen Stifts injiziert. Jeder Chip enthält vier Sätze von Primern und LPs mit verschiedenen elektroaktiven Reportern mit nicht überlappenden Redoxpotentialen, um die Amplifikationsreaktion in Gegenwart der ID-Sequenzen der jeweiligen Teilnehmer auszulösen.

Die Detektionskammer befindet sich auf einer elektrochemischen Mehrkanal-Workstation, die aus einem Verbindungsanschluss zwischen dem elektrochemischen Sensor und dem Detektor, einer Leiterplatte und einer Stromleitung für die externe Anzeige besteht. Die Leiterplatte besteht hauptsächlich aus einer Mikrocontrollereinheit, einem Digital-Analog-Wandler und einem Potentiostatenmodul, um eine differenzielle Pulsvoltammetrieanalyse zu ermöglichen und gleichzeitig die Signale von einer Reihe von Elektroden zu erhalten und dadurch insgesamt 100 Proben zu erfassen.

(iv) Um die Leistung des Prototyps anhand einer klinischen Probe zu validieren und sie mit den Erkennungsdaten von im Handel erhältlichen Testgeräten zu vergleichen.

Die vorgeschlagene Testmethode für gepoolte Proben wird mit dem Goldstandard-RT-PCR-Test hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, positivem Vorhersagewert, negativem Vorhersagewert und Genauigkeit verglichen. Nach dem Nachweis der Validität der aus der vorgeschlagenen Pooling-Strategie gewonnenen Ergebnisse werden die Forscher dann die Möglichkeit untersuchen, Speichel- und Mundgurgelproben anstelle der Nasen-Rachen-Abstriche zu verwenden. Patienten werden vom Prince of Wales Hospital zur Entnahme von Atemwegsproben rekrutiert, um die Genauigkeit dieses Geräts zu bestimmen.

A. Studienverfahren

1. Krankenakten der Teilnehmer zur Erfassung klinischer Daten, einschließlich Alter, Geschlecht, Anzahl der Tage nach Auftreten der Symptome, epidemiologische Exposition gegenüber Personen mit bestätigter COVID-19-Erkrankung, Schweregrad (leicht, mittelschwer, schwer oder kritisch) und Vorhandensein von Begleiterkrankungen werden überprüft.
2. SARS-CoV-2-PCR-Ergebnisse der Teilnehmer aus der elektronischen Krankenhausakte werden abgerufen.
3. Von jedem rekrutierten Patienten werden Nasen-Rachen-Abstriche, Speichel aus dem tiefen Rachen und/oder eine Mundgurgelprobe entnommen.

B. Laborverfahren und Datenanalysen

1. Probenvorbereitung Die von den 200 Patienten gesammelten Proben werden zunächst in zwei Gruppen mit ähnlicher Prävalenz aufgeteilt, und jede Probengröße beträgt 100. Der erste Satz von 100 Proben wird mit kommerziellen viralen RNA-Extraktionskits extrahiert, die von HKUST bereitgestellt werden, und dann für die weitere RT-qPCR-Analyse und die LAMP-basierte Methodenüberprüfung aufbewahrt.
2. RT-qPCR-Assay Um das RT-qPCR-Ergebnis als Referenz vorzubereiten, werden die oben genannten extrahierten Proben mit RT-qPCR für den qualitativen und quantitativen Nachweis von Nukleinsäure aus dem SARS-CoV-2 analysiert, und ein Negativ, ein Positiv und ein Blindkontrollexperiment sollte enthalten sein. Die Zyklusschwellenwerte (Ct) sowie die qualitativen und quantitativen Ergebnisse jeder Probe werden aufgezeichnet. Die RT-qPCR-Verfahren werden von bestehenden CDC-empfohlenen Richtlinien befolgt. Die qPCR-Primer- und Taqman-Sondensets sowie die SARS-CoV-2-RNA-Standardreferenz werden von HKUST bereitgestellt.
3. Experimente mit gepoolten Proben Der zweite Satz von 100 inaktivierten Proben wird nach dem Zufallsprinzip in 25 Gruppen eingeteilt (jede für 4 Proben), und die Ermittler werden SARS-CoV-2-Gruppentests für die 25 Pools unter Verwendung des oben mit HKUST-Forschern entwickelten mikrofluidischen Geräts durchführen. Basierend auf den RT-qPCR-Ergebnissen werden die Sensitivität, Spezifität sowie positive und negative Vorhersagewerte für die weitere Datenanalyse durch HKUST berechnet.

Studiendurchführung

Diese Studie wird in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.