Triagem populacional de COVID-19 em grande escala

As rápidas transmissões de host para host, juntamente com a facilidade de viagens internacionais, levaram a epidemias como H5N1, H5N5, SARS e, mais recentemente, a pandemia de COVID-19. As medidas tradicionais de controle epidêmico, como rastreamento de contatos e isolamento físico, são fundamentais para mitigar a extensão da propagação da doença no estágio inicial da pandemia e essas estratégias dependem da precisão e rapidez no diagnóstico de pacientes suspeitos.

Agora, o padrão-ouro para a detecção de patógenos é a detecção de ácidos nucleicos por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). No entanto, essa estratégia é limitada pelo tempo de resposta, máquina de PCR cara e número potencial de infecções. Assim, outros métodos de amplificação isotérmica são freqüentemente usados ​​para contornar a necessidade de instrumentação extra e acelerar todo o procedimento de detecção.

Uma abordagem para melhorar a eficiência da triagem de doenças infecciosas é o popular teste de Dorfman, em que as amostras são agrupadas e testadas ao mesmo tempo para reduzir o número total de testes realizados. No entanto, o teste de Dorfman é limitado à população de baixa prevalência e tem sensibilidade reduzida; A estratégia de código de barras também foi introduzida para resolver o teste de amostra de agrupamento. Em 2020, Schmid-Burk e seus colegas combinaram LAMP e código de barras que desenvolveram com sucesso o COVID-19 a partir de 100.000 amostras reunidas. No entanto, a necessidade de um sequenciador caro de próxima geração limita seu uso generalizado.

Métodos

A plataforma proposta visa o desenvolvimento de um processo de várias etapas em um dispositivo e a capacidade de identificar a fonte de sinais positivos de amostras agrupadas. O projeto proposto aproveitará uma estratégia de código de barras para marcar várias fontes de analitos antes do agrupamento, uma combinação de amplificação isotérmica e detecção eletroquímica específica de sequência e a integração de várias etapas em um dispositivo simples. A metodologia do projeto de pesquisa será dividida em três partes.

(i) Desenvolver um método de amplificação isotérmica e detecção em tempo real usando sondas de oligonucleotídeos de loop marcadas com eletroativos

Os investigadores recentemente conceituaram um método, para o qual os investigadores apresentaram uma proteção de patente provisória nos EUA. Esta nova técnica realiza a amplificação isotérmica e a detecção eletroquímica de amplicons simultaneamente com base na amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). O esquema proposto envolve um sistema de detecção e amplificação de um pote no qual um repórter eletroquímico é anexado a um dos primers e uma enzima de corte é adicionada para clivar o repórter somente quando ocorre a amplificação. Em uma reação, um DNA molde é projetado para ter dois pares de sítios de ligação de primer: um par externo de primers direto e inverso (FP e BP) e um par interno de primers, ou seja, uma sonda de loop marcada eletroquimicamente (LP) e uma sonda auxiliar (AP). O FP e o LP se ligam à mesma fita do modelo de DNA de fita dupla (dsDNA), enquanto o BP e o AP se ligam à fita oposta. O LP contém um marcador eletroativo na extremidade 5' e um segmento saliente 3' complementar à sequência de DNA alvo. A região da haste contém a sequência de reconhecimento de uma enzima de corte, mas uma incompatibilidade é introduzida no último nucleotídeo para que não seja clivado sem a presença do DNA alvo. O início da reação é semelhante ao LAMP comum, um amplicon de loop duplo pode ser produzido e a reação pode entrar no estágio de amplificação de loop duplo. Cada um dos amplicons de loop duplo pode ser considerado como uma unidade de amplificação de sinal. Uma vez que o LP marcado é combinado com o amplicon e forma um local de clivagem que pode ser reconhecido pela enzima nick, um marcador eletroativo pode ser liberado e um sinal eletroquímico será gerado. Os resultados preliminares indicam que a estratégia é capaz de detectar até 0,1 fg/μL, correspondendo a cerca de 10 cópias/μL do DNA de entrada, usando um repórter eletroativo de azul de metileno em eletrodos de carbono impressos em tela de quatro matrizes (SPCEs) dentro 30 minutos. As etapas seguintes incluem incorporar uma etapa de transcrição reversa para a detecção de amostras de RNA e testar o sistema em matrizes complexas para imitar fluidos biológicos reais.

(ii) Para projetar uma estratégia molecular para codificar quatro amostras individuais para que possam ser agrupadas e amplificar e identificar simultaneamente o indivíduo positivo, se houver, da amostra agrupada.

Ao projetar quatro sequências de código de barras, os investigadores são capazes de construir produtos de cDNA marcados por meio da transcrição reversa pela enzima BST. A exonuclease I termolábil é adicionada para digerir iniciadores de código de barras de fita simples não reagidos. Além disso, o produto dúplice cDNA-RNA é digerido pela RNase H para produzir um cDNA de fita simples (molde ID). A mistura reunida de moldes ID é amplificada através do mesmo processo descrito na seção anterior. Somente as amostras com o vírus de RNA gerarão sinais eletroquímicos positivos.

Nesta parte, os investigadores usarão o RNA do vírus de síntese ou o RNA total do vírus extraído comercialmente como modelo de detecção. As amostras enriquecidas podem ser simuladas misturando-se com saliva humana da garganta profunda ou zaragatoas nasofaríngeas de voluntários saudáveis.

(iii) Fabricar um dispositivo microfluídico para integrar o processador de amostra e o módulo de código de barras com a etapa de amplificação e detecção de ácido nucleico para triagem populacional em larga escala

Neste projeto, os pesquisadores projetam um dispositivo semelhante a uma caneta microfluídica simples e fácil de usar que integra as etapas de preparação da amostra, código de barras e amplificação e detecção. Ele usa propulsão de pistão para fornecer energia para empurrar a amostra para diferentes câmaras. Primeiro, as amostras simuladas são adicionadas a uma câmara de carregamento de amostra onde o tampão de lise é armazenado. Uma mistura de surfactina, SDS e etanol permite a extração rápida do ácido nucleico viral, que é então injetado na câmara de identificação contendo a polimerase BST liofilizada e a mistura de primers ID-tag. A temperatura permanecerá em 37 °C-50 °C para a transcrição reversa. Em seguida, a amostra é injetada na câmara contendo a exonuclease I termolábil. O bloco de aquecimento é então ajustado para 65 ° C por 5 min para desativar a enzima. Posteriormente, as quatro amostras são reunidas e injetadas em um chip de detecção eletroquímica abaixo da caneta microfluídica. Cada chip contém quatro conjuntos de primers e LPs com diferentes repórteres eletroativos com potenciais redox não sobrepostos para desencadear a reação de amplificação na presença das respectivas sequências de ID do participante.

A câmara de detecção fica sobre uma estação de trabalho eletroquímica multicanal, que consiste em uma porta de conexão entre o sensor eletroquímico e o detector, uma placa de circuito e uma linha de energia para exibição externa. A placa de circuito é composta principalmente por uma unidade microcontroladora, um conversor digital-analógico e um módulo potenciostato para permitir a análise de voltametria de pulso diferencial e obter simultaneamente os sinais de uma matriz de eletrodos e, assim, detectar um total de 100 amostras.

(iv) Validar o desempenho do protótipo usando uma amostra clínica e compará-lo com os dados de detecção de equipamentos de teste disponíveis comercialmente.

O método proposto de teste de amostra agrupada será comparado com o teste padrão-ouro RT-PCR em termos de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e precisão. Depois de demonstrar a validade dos resultados obtidos com a estratégia de agrupamento proposta, os investigadores explorarão a possibilidade de usar amostras de saliva e gargarejos bucais em vez dos swabs nasofaríngeos. Os pacientes serão recrutados no Hospital Prince of Wales para coleta de amostras respiratórias para determinar a precisão deste dispositivo.

A. Procedimentos de estudo

1. Registros médicos dos participantes para coletar dados clínicos, incluindo idade, sexo, número de dias após o início dos sintomas, exposição epidemiológica a pessoas com doença confirmada por COVID-19, gravidade (leve, moderada, grave ou crítica) e presença de comorbidades serão revisadas.
2. Os resultados do PCR SARS-CoV-2 dos participantes do registro eletrônico do hospital serão recuperados.
3. Serão coletadas amostras de swab nasofaríngeo, saliva da garganta profunda e/ou gargarejo bucal de cada paciente recrutado.

B. Procedimentos laboratoriais e análises de dados

1. Preparo da amostra As amostras coletadas dos 200 pacientes serão inicialmente divididas em dois conjuntos com prevalências semelhantes, sendo que cada tamanho amostral é de 100. O primeiro conjunto de 100 amostras será extraído usando kits comerciais de extração de RNA viral fornecidos pela HKUST e, em seguida, armazenado para posterior análise de RT-qPCR e verificação do método baseado em LAMP.
2. Ensaio RT-qPCR Para preparar o resultado RT-qPCR como referência, as amostras extraídas mencionadas acima serão analisadas usando RT-qPCR para a detecção qualitativa e quantitativa de ácido nucleico do SARS-CoV-2, e um negativo, um positivo e um experimento de controle em branco deve ser incluído. Serão registrados os valores dos limites do ciclo (Ct), resultados qualitativos e quantitativos de cada amostra. Os procedimentos de RT-qPCR serão seguidos pelas diretrizes existentes recomendadas pelo CDC. O primer qPCR e os conjuntos de sondas Taqman e a referência padrão de RNA do SARS-CoV-2 serão fornecidos pela HKUST.
3. Experimentos de amostras agrupadas O segundo conjunto de 100 amostras inativadas será dividido em 25 grupos aleatoriamente (cada um para 4 amostras), e os investigadores realizarão testes de grupo SARS-CoV-2 para os 25 pools usando o dispositivo microfluídico desenvolvido acima com pesquisadores do HKUST. Com base nos resultados de RT-qPCR, a sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos serão calculados para posterior análise de dados pelo HKUST.

Conduta do estudo

Este estudo será conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.