大规模 COVID-19 人群筛查

快速的宿主间传播加上国际旅行的便利性导致了 H5N1、H5N5、SARS 以及最近的 COVID-19 大流行等流行病。 传统的流行病控制措施，例如接触者追踪和物理隔离，对于减轻大流行早期的疾病传播范围至关重要，这些策略取决于诊断疑似患者的准确性和速度。

现在病原体检测的金标准是通过聚合酶链反应 (PCR) 进行核酸检测。 然而，这种策略受到周转时间、昂贵的 PCR 机器和潜在感染数量的限制。 因此，经常使用其他等温扩增方法来规避对额外仪器的需要并加快整个检测过程。

提高传染病筛查效率的一种方法是流行的 Dorfman 测试，将样本集中在一起并同时进行测试，以减少执行的测试总数。 然而，Dorfman 测试仅限于低流行人群并且敏感性降低；还引入了条形码策略来解决合并样本测试。 2020 年，Schmid-Burk 和他的同事将 LAMP 和条形码结合起来，成功地从 100,000 个合并样本中开发出 COVID-19。 然而，对昂贵的下一代测序仪的需求限制了它的广泛使用。

方法

拟议的平台旨在在一​​个设备中开发多步骤过程，并能够从混合样本中识别阳性信号的来源。 拟议的设计将利用条形码策略在汇集之前标记多个分析物来源，结合等温扩增和序列特异性电化学检测，以及将多个步骤集成到一个简单的设备中。 研究项目方法将分为三个部分。

(i) 使用电活性标记的环状寡核苷酸探针开发等温扩增方法和实时检测

研究人员最近构思了一种方法，研究人员已为此申请了美国临时专利保护。 这种新技术基于环介导等温扩增 (LAMP)，同时对扩增子进行等温扩增和电化学检测。 拟议的方案涉及一个单锅扩增和检测系统，其中一个电化学报告器连接到其中一个引物，并添加一种切口酶以仅在发生扩增时切割报告器。 在一个反应​​中，模板 DNA 被设计成具有两对引物结合位点：一对外部正向和反向引物（FP 和 BP）和一对内部引物，即电化学标记的环探针（LP）和一个辅助探针 (AP)。 FP 和 LP 与双链 DNA (dsDNA) 模板的同一条链结合，而 BP 和 AP 与相反的链结合。 LP 在 5' 端包含一个电活性标记和一个与目标 DNA 序列互补的 3' 突出部分。 茎区包含切口酶的识别序列，但在最后一个核苷酸中引入了错配，因此在目标 DNA 不存在的情况下它不会被切割。 反应开始与普通LAMP类似，可产生双环扩增子，反应进入双环扩增阶段。 每个双环扩增子都可以看作是一个信号放大单元。 一旦标记的 LP 与扩增子结合并形成可被切口酶识别的切割位点，就可以释放电活性标记，并产生电化学信号。 初步结果表明，通过在四阵列丝网印刷碳电极 (SPCE) 上使用亚甲蓝电活性报告基因，该策略能够检测高达 0.1 fg/μL，对应于大约 10 拷贝/μL 的输入 DNA 30分钟。 随后的步骤包括合并逆转录步骤以检测 RNA 样本，并在复杂矩阵中测试系统以模拟实际生物体液。

(ii) 设计一种分子策略，对四个单独的样本进行条码化，以便将它们合并在一起，同时从合并样本中扩增和识别阳性个体（如果有的话）。

通过设计四个条形码序列，研究人员能够通过 BST 酶的逆转录构建带标签的 cDNA 产物。 添加耐热核酸外切酶 I 以消化未反应的单链条形码引物。 此外，cDNA-RNA 双链体产物被 RNase H 消化，产生单链 cDNA（ID 模板）。ID 模板的混合混合物通过上一节中描述的相同过程进行扩增。 只有那些带有 RNA 病毒的样品才会产生正电化学信号。

在这一部分，研究者将使用合成病毒RNA或商业提取的病毒总RNA作为检测模板。 加标样品可以通过与人类深喉唾液或健康志愿者的鼻咽拭子混合来模拟。

(iii) 制造微流控装置，将样本处理器和条形码模块与核酸扩增和检测步骤集成在一起，用于大规模人群筛查

在这个项目中，研究人员设计了一种简单易用的微流控笔状装置，集成了样品制备、条形码、扩增和检测等步骤。 它使用活塞推进提供动力将样品推入不同的腔室。 首先，将模拟样品添加到储存裂解缓冲液的样品装载室中。 表面活性素、SDS 和乙醇的混合物可以快速提取病毒核酸，然后将其注入含有冻干 BST 聚合酶和 ID 标签引物混合物的鉴定室。 温度将保持在 37°C-50°C 以进行逆转录。 然后，将样品注入含有不耐热核酸外切酶 I 的腔室中。 然后将加热块设置为 65°C 5 分钟以使酶失活。 此后，将四个样品汇集在一起​​并注入微流控笔下方的电化学检测芯片中。 每个芯片包含四组引物和 LPs，具有不同的电活性记者，具有不重叠的氧化还原电位，以在存在各自参与者的 ID 序列的情况下触发放大反应。

检测室位于多通道电化学工作站的顶部，该工作站由电化学传感器和检测器之间的连接端口、电路板和用于外部显示的电源线组成。 该电路板主要由微控制器单元、数模转换器和恒电位仪模块组成，可以进行差分脉冲伏安分析，同时获取电极阵列的信号，从而检测总共100个样品。

(iv) 使用临床标本验证原型的性能，并将其与商用测试设备的检测数据进行基准测试。

所提出的合并样本检测方法将在灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性方面与金标准 RT-PCR 检测进行比较。 在证明从拟议的合并策略中获得的结果的有效性后，研究人员将探索使用唾液和漱口液样本代替鼻咽拭子的可能性。 将从威尔士亲王医院招募患者，收集呼吸道样本以确定该设备的准确性。

A. 学习程序

1. 参与者的医疗记录以收集临床数据，包括年龄、性别、出现症状后的天数、与确诊 COVID-19 疾病患者的流行病学接触、严重程度（轻度、中度、重度或危重）以及是否存在合并症将被审查。
2. 将从医院电子记录中检索参与者的 SARS-CoV-2 PCR 结果。
3. 将收集每位招募患者的鼻咽拭子、深喉唾液和/或漱口液样本。

B. 实验室程序和数据分析

1. 样本制备 将从 200 名患者中采集的样本首先分成患病率相似的两组，每组样本量为 100。 首批100个样本将使用香港科技大学提供的商业病毒RNA提取试剂盒提取，然后保存以供进一步RT-qPCR分析和基于LAMP的方法验证。
2. RT-qPCR 测定 为准备 RT-qPCR 结果作为参考，将使用 RT-qPCR 分析上述提取的样本，对 SARS-CoV-2 核酸进行定性和定量检测，阴性、阳性并应包括空白对照实验。 将记录每个样品的循环阈值 (Ct) 值、定性和定量结果。 RT-qPCR 程序将遵循现有的 CDC 推荐指南。 qPCR 引物和 Taqman 探针组，以及 SARS-CoV-2 RNA 标准参考将由香港科技大学提供。
3. 合并样本实验 第二组100个灭活样本将随机分为25组（每组4个样本），研究人员将使用上述与科大研究人员开发的微流控装置对25个合并样本进行SARS-CoV-2分组检测。 科大将根据RT-qPCR结果计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，供科大进一步分析。

学习行为

本研究将根据赫尔辛基宣言进行。