Laajamittainen COVID-19 väestöseulonta

Nopeat isännältä isännälle leviäminen yhdistettynä kansainvälisen matkustamisen helppouteen on johtanut epidemioihin, kuten H5N1, H5N5, SARS ja viimeksi COVID-19-pandemia. Perinteiset epidemian torjuntatoimenpiteet, kuten kontaktien jäljitys ja fyysinen eristäminen, ovat ensiarvoisen tärkeitä taudin leviämisen hillitsemiseksi pandemian varhaisessa vaiheessa, ja nämä strategiat riippuvat epäiltyjen potilaiden diagnoosin tarkkuudesta ja nopeudesta.

Nyt kultainen standardi patogeenien havaitsemisessa on nukleiinihappojen havaitseminen polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla. Tätä strategiaa rajoittavat kuitenkin läpimenoaika, kallis PCR-kone ja mahdollinen infektioiden määrä. Siten muita isotermisiä vahvistusmenetelmiä käytetään usein välttämään ylimääräisten instrumenttien tarve ja nopeuttamaan koko ilmaisumenettelyä.

Eräs tapa parantaa tartuntatautien seulonnan tehokkuutta on suosittu Dorfman-testaus, jossa näytteet yhdistetään ja testataan samaan aikaan tehtyjen testien kokonaismäärän vähentämiseksi. Dorfman-testaus on kuitenkin rajoitettu alhaisen esiintyvyyden populaatioon ja sen herkkyys on heikentynyt; Viivakoodausstrategia on myös otettu käyttöön pooling sample testin ratkaisemiseksi. Vuonna 2020 Schmid-Burk ja hänen kollegansa yhdistivät LAMP:n ja viivakoodin, mikä onnistui kehittämään COVID-19:n 100 000 yhdistetystä näytteestä. Kalliin seuraavan sukupolven sekvensserin tarve rajoittaa kuitenkin sen laajaa käyttöä.

menetelmät

Ehdotetun alustan tavoitteena on kehittää monivaiheinen prosessi yhdessä laitteessa ja kyky tunnistaa positiivisten signaalien lähde yhdistetyistä näytteistä. Ehdotetussa suunnittelussa hyödynnetään viivakoodistrategiaa useiden analyyttilähteiden merkitsemiseksi ennen yhdistämistä, isotermisen monistuksen ja sekvenssispesifisen sähkökemiallisen havaitsemisen yhdistelmää ja useiden vaiheiden integrointia yhteen yksinkertaiseen laitteeseen. Tutkimusprojektin metodologia jaetaan kolmeen osaan.

(i) Kehittää isoterminen monistusmenetelmä ja reaaliaikainen havaitseminen käyttämällä elektroaktiivisesti leimattuja silmukkaoligonukleotidikoettimia

Tutkijat ovat hiljattain konseptoineet menetelmän, jolle tutkijat ovat hakeneet USA:n väliaikaisen patenttisuojan. Tämä uusi tekniikka suorittaa amplikonien isotermisen vahvistuksen ja sähkökemiallisen havaitsemisen samanaikaisesti perustuen Loop-mediated isothermal amplifikaatioon (LAMP). Ehdotettu kaavio sisältää yhden astian monistus- ja detektiojärjestelmän, jossa sähkökemiallinen reportteri liitetään yhteen alukkeista ja nicking-entsyymi lisätään reportterin katkaisemiseksi vain, kun monistus tapahtuu. Yhdessä reaktiossa templaatti-DNA on suunniteltu sisältämään kaksi paria alukkeen sitoutumiskohtia: ulompi pari eteenpäin ja taaksepäin alukkeita (FP ja BP) ja sisäinen alukepari, nimittäin sähkökemiallisesti leimattu silmukkakoetin (LP) ja avustava luotain (AP). FP ja LP sitoutuvat kaksijuosteisen DNA:n (dsDNA) templaatin samaan juosteeseen, kun taas BP ja AP sitoutuvat vastakkaiseen juosteeseen. LP sisältää elektroaktiivisen leiman 5'-päässä ja 3'-ulkoisen segmentin, joka on komplementaarinen kohde-DNA-sekvenssille. Varsialue sisältää nicking-entsyymin tunnistussekvenssin, mutta yhteensopimattomuus tuodaan viimeiseen nukleotidiin, jotta se ei katkea ilman kohde-DNA:n läsnäoloa. Reaktion alku on samanlainen kuin tavallisessa LAMP:ssa, kaksisilmukkainen amplikoni voidaan tuottaa ja reaktio voi tulla kaksoissilmukan monistusvaiheeseen. Jokaista kaksoissilmukaista vahvistinta voidaan pitää signaalinvahvistusyksikkönä. Kun leimattu LP on yhdistetty amplikonin kanssa ja muodostaa pilkkoutumiskohdan, jonka nick-entsyymi voi tunnistaa, sähköaktiivinen leima voidaan vapauttaa ja sähkökemiallinen signaali syntyy. Alustavat tulokset osoittavat, että strategia pystyy havaitsemaan jopa 0,1 fg/μl, mikä vastaa noin 10 kopiota/μl syöte-DNA:ta, käyttämällä metyleenisinistä sähköaktiivista reportteria neljän ryhmän silkkipainetuissa hiilielektrodeissa (SPCE) 30 min. Seuraavat vaiheet sisältävät käänteistranskriptiovaiheen sisällyttämisen RNA-näytteiden havaitsemiseen ja järjestelmän testaamiseen monimutkaisissa matriiseissa todellisten biologisten nesteiden jäljittelemiseksi.

(ii) Suunnittelemaan molekyylistrategia neljän yksittäisen näytteen viivakoodaamiseksi, jotta ne voidaan yhdistää, ja samanaikaisesti monistaa ja tunnistaa positiivinen yksilö, jos sellainen on yhdistetty näytteestä.

Suunnittelemalla neljä viivakoodisekvenssiä tutkijat pystyvät rakentamaan merkittyjä cDNA-tuotteita BST-entsyymin käänteistranskription avulla. Termolaabiili eksonukleaasi I lisätään pilkkomaan reagoimattomia yksijuosteisia viivakoodialukkeita. Lisäksi cDNA-RNA-dupleksituote pilkotaan RNaasi H:lla, jolloin saadaan yksijuosteinen cDNA (ID-templaatti). ID-templaattien yhdistetty seos monistetaan samalla menetelmällä, joka on kuvattu edellisessä osassa. Vain ne näytteet, joissa on RNA-virusta, tuottavat positiivisia sähkökemiallisia signaaleja.

Tässä osassa tutkijat käyttävät synteesiviruksen RNA:ta tai kaupallisesti uutettua viruksen kokonais-RNA:ta detektiotemplaattina. Piikkinäytteitä voidaan pilkata sekoittamalla ihmisen syvän kurkun syljen tai terveiden vapaaehtoisten nenänielun vanupuikkoihin.

(iii) valmistaa mikrofluidilaite näyteprosessorin ja viivakoodimoduulin integroimiseksi nukleiinihapon monistus- ja havaitsemisvaiheeseen laajamittaista populaatioseulontaa varten

Tässä projektissa tutkijat suunnittelevat yksinkertaisen ja helppokäyttöisen mikrofluidikynän kaltaisen laitteen, joka yhdistää näytteen valmistelun, viivakoodauksen sekä vahvistuksen ja havaitsemisen vaiheet. Se käyttää männän propulsiovoimaa näytteen työntämiseen eri kammioihin. Ensin valenäytteet lisätään näytteen latauskammioon, jossa lyysipuskuri säilytetään. Surfaktiinin, SDS:n ja etanolin seos mahdollistaa viruksen nukleiinihapon nopean uuttamisen, joka sitten injektoidaan alas tunnistuskammioon, joka sisältää pakastekuivatun BST-polymeraasin ja ID-merkin alukeseoksen. Lämpötila pysyy 37 °C - 50 °C käänteistranskriptiota varten. Sitten näyte ruiskutetaan kammioon, joka sisältää termolabiilin eksonukleaasi I:n. Kuumennuslohko asetetaan sitten 65 °C:seen 5 minuutiksi entsyymin deaktivoimiseksi. Sen jälkeen neljä näytettä yhdistetään ja injektoidaan mikrofluidikynän alla olevaan sähkökemialliseen tunnistussiruun. Jokainen siru sisältää neljä sarjaa alukkeita ja LP:itä, joissa on erilaiset sähköaktiiviset reportterit, joilla on ei-päällekkäiset redox-potentiaalit, jotka laukaisevat amplifikaatioreaktion vastaavien osallistujan ID-sekvenssien läsnä ollessa.

Havaintokammio sijaitsee monikanavaisen sähkökemiallisen työaseman päällä, joka koostuu sähkökemiallisen anturin ja ilmaisimen välisestä liitäntäportista, piirilevystä ja virtajohdosta ulkoista näyttöä varten. Piirilevy koostuu pääasiassa mikrokontrolleriyksiköstä, digitaali-analogiamuuntimesta ja potentiostaattimoduulista, joka mahdollistaa differentiaalisen pulssivoltametrian analyysin ja samanaikaisesti signaalin vastaanottamisen elektrodijoukosta ja siten yhteensä 100 näytettä havaitsemisen.

(iv) validoida prototyypin suorituskyky käyttämällä kliinistä näytettä ja vertailla sitä kaupallisesti saatavien testauslaitteiden havaitsemistietoihin.

Ehdotettua yhdistetyn näytteen testausmenetelmää verrataan kultastandardin RT-PCR-testiin herkkyyden, spesifisyyden, positiivisen ennustusarvon, negatiivisen ennustusarvon ja tarkkuuden suhteen. Osoitettuaan ehdotetusta yhdistämisstrategiasta saatujen tulosten pätevyyden tutkijat tutkivat sen jälkeen mahdollisuutta käyttää sylki- ja suukurkkunäytteitä nenänielun pyyhkäisynäytteiden sijasta. Potilaat palkataan Prince of Walesin sairaalasta ottamaan hengitysnäytteitä tämän laitteen tarkkuuden määrittämiseksi.

A. Tutkimusmenettelyt

1. Osallistujien lääketieteelliset tiedot kliinisten tietojen keräämiseksi, mukaan lukien ikä, sukupuoli, päivien lukumäärä oireiden alkamisen jälkeen, epidemiologinen altistuminen ihmisille, joilla on vahvistettu COVID-19-tauti, vakavuus (lievä, kohtalainen, vaikea tai kriittinen) ja liitännäissairaudet tarkistetaan.
2. Osallistujien SARS-CoV-2 PCR-tulokset noudetaan sairaalan sähköisestä tietueesta.
3. Jokaiselta värvätyltä potilaalta otetaan nenänielun vanupuikko, syvän kurkun sylki ja/tai suukurkkunäyte.

B. Laboratoriomenettelyt ja tietoanalyysit

1. Näytteen valmistelu 200 potilaasta kerätyt näytteet jaetaan ensin kahteen ryhmään, joilla on samanlainen esiintyvyys, ja kunkin näytteen koko on 100. Ensimmäiset 100 näytettä uutetaan käyttämällä kaupallisia HKUST:n toimittamia viruksen RNA:n uuttopakkauksia ja säilytetään sitten RT-qPCR-analyysiä ja LAMP-pohjaista menetelmän todentamista varten.
2. RT-qPCR-määritys RT-qPCR-tuloksen valmistamiseksi referenssinä edellä mainituista näytteet analysoidaan käyttämällä RT-qPCR:tä SARS-CoV-2:n nukleiinihapon kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen havaitsemiseen ja negatiivinen, positiivinen. ja nollakontrollikoe tulisi sisällyttää. Jokaisen näytteen syklin kynnysarvot (Ct) sekä kvalitatiiviset ja kvantitatiiviset tulokset kirjataan. RT-qPCR-menettelyjä noudatetaan olemassa olevien CDC:n suosittelemien ohjeiden mukaisesti. HKUST toimittaa qPCR-alukkeen ja Taqman-koetinsarjat sekä SARS-CoV-2-RNA-standardiviitteen.
3. Yhdistelmänäytekokeet Toinen sarja 100 inaktivoitua näytettä jaetaan 25 ryhmään satunnaisesti (kukin 4 näytettä varten), ja tutkijat suorittavat SARS-CoV-2-ryhmätestauksen 25 poolille käyttämällä edellä HKUST-tutkijoiden kanssa kehitettyä mikrofluidilaitetta. RT-qPCR-tulosten perusteella lasketaan herkkyys, spesifisyys sekä positiiviset ja negatiiviset ennustusarvot HKUST:n suorittamaa lisätietojen analysointia varten.

Opiskelutapa

Tämä tutkimus tehdään Helsingin julistuksen mukaisesti.