Storskalig COVID-19 befolkningsscreening

Snabba sändningar från värd till värd i kombination med det enkla internationella resandet har lett till epidemier som H5N1, H5N5, SARS och nu senast covid-19-pandemin. Traditionella epidemikontrollåtgärder, såsom kontaktspårning och fysisk isolering, är avgörande för att mildra omfattningen av sjukdomsspridning i ett tidigt skede av pandemin och dessa strategier beror på noggrannheten och hastigheten för diagnostisering av misstänkta patienter.

Nu är guldstandarden för detektion av patogener nukleinsyradetektion via polymeraskedjereaktion (PCR). Denna strategi är dock begränsad av handläggningstiden, dyr PCR-maskin och potentiellt antal infektioner. Således används ofta andra isotermiska amplifieringsmetoder för att kringgå behovet av extra instrumentering och påskynda hela detektionsproceduren.

Ett tillvägagångssätt för att förbättra effektiviteten i screening av infektionssjukdomar är det populära Dorfman-testet, där prover slås samman och testas samtidigt för att minska det totala antalet utförda tester. Dorfman-testningen är dock begränsad till lågprevalenspopulation och har minskad känslighet; Streckkodsstrategi har också införts för att lösa poolningsprovtest. År 2020 kombinerade Schmid-Burk och hans kollegor LAMP och streckkodning som framgångsrikt utvecklade COVID-19 från 100 000 poolade prover. Men behovet av en dyr nästa generations sequencer begränsar dess utbredda användning.

Metoder

Den föreslagna plattformen syftar till utveckling av en flerstegsprocess i en enhet, och förmågan att identifiera källan till positiva signaler från poolade prover. Den föreslagna designen kommer att dra fördel av en streckkodsstrategi för att märka flera analytkällor före poolning, en kombination av isotermisk amplifiering och sekvensspecifik elektrokemisk detektion, och integrationen av flera steg i en enkel enhet. Forskningsprojektets metodik kommer att delas upp i tre delar.

(i) Att utveckla en isotermisk amplifieringsmetod och realtidsdetektion med användning av elektroaktivt märkta loop-oligonukleotidsonder

Utredarna har nyligen tagit fram en metod, för vilken utredarna har lämnat in ett amerikanskt provisoriskt patentskydd. Denna nya teknik utför isotermisk amplifiering och elektrokemisk detektion av amplikoner samtidigt baserat på Loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP). Det föreslagna schemat involverar ett amplifierings- och detektionssystem i en behållare i vilket en elektrokemisk rapportör är fäst vid en av primrarna och ett hackningsenzym tillsätts för att klyva reportern endast när amplifiering sker. I en reaktion är ett mall-DNA utformat för att ha två par primerbindningsställen: ett yttre par framåt- och bakåtprimrar (FP och BP) och ett inre par primers, nämligen en elektrokemiskt märkt loop-sond (LP) och en assisterande sond (AP). FP och LP binder till samma sträng av den dubbelsträngade DNA (dsDNA) mallen medan BP och AP binder till den motsatta strängen. LP innehåller en elektroaktiv markör vid 5'-änden och ett 3'-överhängande segment som är komplementärt till mål-DNA-sekvensen. Stamregionen innehåller igenkänningssekvensen för ett nicking-enzym, men en felparning introduceras till den sista nukleotiden så att den inte kommer att klyvas utan närvaron av mål-DNA:t. Starten av reaktionen liknar vanlig LAMP, en dubbelloopamplikon kan produceras, och reaktionen kan komma in i dubbelloopamplifieringssteget. Var och en av dubbelslingamplikonerna kan betraktas som en signalförstärkningsenhet. När den märkta LP har kombinerats med amplikonet och bildar ett klyvningsställe som kan kännas igen av nickenzymet, kan en elektroaktiv markör frigöras och en elektrokemisk signal kommer att genereras. De preliminära resultaten indikerar att strategin kan detektera upp till 0,1 fg/μL, motsvarande cirka 10 kopior/μL av inmatat DNA, genom att använda en metylenblå elektroaktiv reporter på screentryckta kolelektroder med fyra arrayer (SPCE) inom 30 minuter. De efterföljande stegen inkluderar inkorporering av ett omvänd transkriptionssteg för detektion av RNA-prover och testning av systemet i komplexa matriser för att efterlikna faktiska biologiska vätskor.

(ii) Att utforma en molekylär strategi för att streckkoda fyra individuella prover så att de kan slås samman och för att samtidigt amplifiera och identifiera den positiva individen, om någon, från det poolade provet.

Genom att designa fyra streckkodssekvenser kan utredarna konstruera taggade cDNA-produkter genom omvänd transkription av BST-enzym. Termolabilt exonukleas I tillsätts för att smälta oreagerade enkelsträngs streckkodsprimrar. Dessutom digereras cDNA-RNA-duplexprodukten av RNase H för att ge ett enkelsträngat cDNA (ID-mall). Den sammanslagna blandningen av ID-mallar amplifieras genom samma process som beskrivs i föregående avsnitt. Endast de prover med RNA-virus kommer att generera positiva elektrokemiska signaler.

I denna del kommer utredarna att använda syntesvirus-RNA eller kommersiellt extraherat virus totalt RNA som en detektionsmall. De spetsade proverna kan hånas genom att blandas med mänsklig saliv i djup hals eller nasofarynxprover från friska frivilliga.

(iii) Att tillverka en mikrofluidisk enhet för att integrera provprocessorn och streckkodsmodulen med nukleinsyraamplifierings- och detektionssteget för storskalig populationsscreening

I detta projekt designar utredarna en enkel och lättanvänd mikrofluidisk pennliknande enhet som integrerar stegen för provberedning, streckkodning och amplifiering och detektion. Den använder kolvframdrivning för att ge kraft för att trycka in provet i olika kammare. Först läggs skenproverna till en provladdningskammare där lysbufferten lagras. En blandning av surfaktin, SDS och etanol möjliggör snabb extraktion av viral nukleinsyra, som sedan injiceras ner till identifieringskammaren som innehåller det frystorkade BST-polymeraset och ID-tag-primerblandningen. Temperaturen kommer att förbli vid 37 °C-50 °C för omvänd transkription. Därefter injiceras provet i kammaren som innehåller termolabilt exonukleas I. Värmeblocket ställs sedan in på 65 °C i 5 minuter för att avaktivera enzymet. Därefter slås de fyra proverna samman och injiceras i ett elektrokemiskt detektionschip under den mikrofluidiska pennan. Varje chip innehåller fyra uppsättningar primrar och LP:er med olika elektroaktiva reportrar med icke-överlappande redoxpotentialer för att utlösa amplifieringsreaktionen i närvaro av respektive deltagares ID-sekvenser.

Detektionskammaren sitter ovanpå en flerkanalig elektrokemisk arbetsstation, som består av en anslutningsport mellan den elektrokemiska sensorn och detektorn, ett kretskort och en kraftledning för extern display. Kretskortet består huvudsakligen av en mikrokontrollerenhet, en digital-till-analog-omvandlare och en potentiostatmodul för att möjliggöra differentiell pulsvoltammetrianalys och samtidigt erhålla signalerna från en uppsättning elektroder och därigenom detektera totalt 100 sampel.

(iv) Att validera prestandan hos prototypen med hjälp av ett kliniskt prov och jämföra det med detektionsdata från kommersiellt tillgänglig testutrustning.

Den föreslagna metoden för testning av poolade prover kommer att jämföras med RT-PCR-testet i guldstandard när det gäller sensitivitet, specificitet, positivt prediktivt värde, negativt prediktivt värde och noggrannhet. Efter att ha visat giltigheten av de resultat som erhållits från den föreslagna poolningsstrategin kommer utredarna att undersöka möjligheten att använda saliv- och mungurgleprov i stället för nasofarynxproverna. Patienter kommer att rekryteras från Prince of Wales Hospital för insamling av andningsprover för att fastställa noggrannheten hos denna enhet.

A. Studieprocedurer

1. Deltagarnas journaler för att samla in kliniska data, inklusive ålder, kön, antal dagar efter symptomdebut, epidemiologisk exponering för personer med bekräftad covid-19-sjukdom, svårighetsgrad (lindrig, måttlig, svår eller kritisk) och förekomsten av komorbiditeter kommer att ses över.
2. SARS-CoV-2 PCR-resultat från deltagarna från sjukhusets elektroniska register kommer att hämtas.
3. Nasofaryngeal pinnprover, djup halssaliv och/eller mungurgleprov från varje rekryterad patient kommer att samlas in.

B. Laboratorieförfaranden och dataanalyser

1. Provberedning Proverna som samlas in från de 200 patienterna kommer först att delas upp i två uppsättningar med liknande prevalens, och varje provstorlek är 100. De första 100 proverna kommer att extraheras med hjälp av kommersiella virala RNA-extraktionssatser från HKUST och lagras sedan för ytterligare RT-qPCR-analys och LAMP-baserad metodverifiering.
2. RT-qPCR-analys För att förbereda RT-qPCR-resultat som referens, kommer de extraherade proverna från ovan att analyseras med RT-qPCR för kvalitativ och kvantitativ detektion av nukleinsyra från SARS-CoV-2, och en negativ, en positiv och ett blankkontrollexperiment bör inkluderas. Cykeltröskelvärdena (Ct), kvalitativa och kvantitativa resultat för varje prov kommer att registreras. RT-qPCR-procedurerna kommer att följas av befintliga CDC-rekommenderade riktlinjer. qPCR-primer- och Taqman-probuppsättningarna och SARS-CoV-2 RNA-standardreferens kommer att tillhandahållas av HKUST.
3. Poolade provexperiment Den andra uppsättningen 100 inaktiverade prover kommer att delas in i 25 grupper slumpmässigt (var och en för 4 prover), och utredarna kommer att utföra SARS-CoV-2-grupptester för de 25 poolerna med hjälp av den mikrofluidiska enheten som utvecklats ovan tillsammans med HKUST-forskare. Baserat på RT-qPCR-resultaten kommer känsligheten, specificiteten och positiva och negativa prediktiva värden att beräknas för ytterligare dataanalys av HKUST.

Studieuppförande

Denna studie kommer att genomföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen.