Badania przesiewowe populacji COVID-19 na dużą skalę

Szybkie transmisje między hostami w połączeniu z łatwością podróży międzynarodowych doprowadziły do ​​epidemii, takich jak H5N1, H5N5, SARS, a ostatnio do pandemii COVID-19. Tradycyjne środki kontroli epidemii, takie jak ustalanie kontaktów zakaźnych i izolacja fizyczna, mają kluczowe znaczenie dla ograniczenia rozprzestrzeniania się choroby na wczesnym etapie pandemii, a strategie te zależą od dokładności i szybkości diagnozowania podejrzanych pacjentów.

Obecnie złotym standardem wykrywania patogenów jest wykrywanie kwasu nukleinowego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Strategia ta jest jednak ograniczona czasem realizacji, kosztowną maszyną do PCR i potencjalną liczbą infekcji. Dlatego często stosuje się inne metody amplifikacji izotermicznej, aby ominąć potrzebę dodatkowego oprzyrządowania i przyspieszyć całą procedurę wykrywania.

Jednym ze sposobów poprawy skuteczności badań przesiewowych w kierunku chorób zakaźnych jest popularny test Dorfmana, w którym próbki są łączone i testowane w tym samym czasie, aby zmniejszyć całkowitą liczbę przeprowadzanych testów. Jednak test Dorfmana jest ograniczony do populacji o niskim rozpowszechnieniu i ma zmniejszoną czułość; Wprowadzono również strategię kodów kreskowych w celu rozwiązania testu łączenia próbek. W 2020 roku Schmid-Burk i jego współpracownicy połączyli LAMP i kody kreskowe, dzięki czemu z powodzeniem opracowali COVID-19 ze 100 000 połączonych próbek. Jednak potrzeba kosztownego sekwencera nowej generacji ogranicza jego powszechne zastosowanie.

Metody

Proponowana platforma ma na celu opracowanie wieloetapowego procesu w jednym urządzeniu oraz możliwość identyfikacji źródła dodatnich sygnałów ze zbiorczych próbek. Proponowany projekt będzie wykorzystywał strategię kodowania kreskowego do oznaczania wielu źródeł analitów przed połączeniem, połączenie amplifikacji izotermicznej i specyficznej dla sekwencji detekcji elektrochemicznej oraz integrację kilku etapów w jednym prostym urządzeniu. Metodologia projektu badawczego zostanie podzielona na trzy części.

(i) Opracowanie metody amplifikacji izotermicznej i wykrywania w czasie rzeczywistym przy użyciu sond oligonukleotydowych pętlowych znakowanych elektroaktywnie

Badacze opracowali niedawno koncepcję metody, dla której złożyli tymczasową ochronę patentową w USA. Ta nowa technika polega na jednoczesnej amplifikacji izotermicznej i elektrochemicznej detekcji amplikonów w oparciu o amplifikację izotermiczną za pośrednictwem pętli (LAMP). Proponowany schemat obejmuje system amplifikacji i detekcji w jednym naczyniu, w którym reporter elektrochemiczny jest przyłączony do jednego ze starterów, a enzym nacinający jest dodawany w celu rozszczepienia reportera tylko wtedy, gdy nastąpi amplifikacja. W jednej reakcji matryca DNA jest zaprojektowana tak, aby miała dwie pary miejsc wiązania starterów: zewnętrzną parę starterów do przodu i do tyłu (FP i BP) oraz wewnętrzną parę starterów, a mianowicie znakowaną elektrochemicznie sondę pętlową (LP) i sonda pomocnicza (AP). FP i LP wiążą się z tą samą nicią matrycy dwuniciowego DNA (dsDNA), podczas gdy BP i AP wiążą się z przeciwną nicią. LP zawiera znacznik elektroaktywny na końcu 5' i wystający segment 3' komplementarny do docelowej sekwencji DNA. Region łodygi zawiera sekwencję rozpoznawaną przez enzym nacinający, ale do ostatniego nukleotydu wprowadza się niedopasowanie, tak że nie zostanie on rozszczepiony bez obecności docelowego DNA. Początek reakcji jest podobny do zwykłego LAMP, można wytworzyć amplikon z podwójną pętlą, a reakcja może przejść do etapu amplifikacji z podwójną pętlą. Każdy z amplikonów z podwójną pętlą można traktować jako jednostkę wzmacniającą sygnał. Gdy znakowany LP połączy się z amplikonem i utworzy miejsce rozszczepienia, które może zostać rozpoznane przez enzym nacinający, znacznik elektroaktywny może zostać uwolniony i zostanie wygenerowany sygnał elektrochemiczny. Wstępne wyniki wskazują, że strategia jest w stanie wykryć do 0,1 fg/μl, co odpowiada około 10 kopiom/μl wejściowego DNA, przy użyciu elektroaktywnego reportera błękitu metylenowego na czteromacierzowych sitodrukowanych elektrodach węglowych (SPCE) w ciągu 30 minut. Kolejne etapy obejmują włączenie etapu odwrotnej transkrypcji do wykrywania próbek RNA i testowanie systemu na złożonych matrycach w celu naśladowania rzeczywistych płynów biologicznych.

(ii) Zaprojektować strategię molekularną kodowania kreskowego czterech pojedynczych próbek, aby można je było połączyć razem i jednocześnie powielić i zidentyfikować osobę dodatnią, jeśli taka istnieje, z połączonej próbki.

Projektując cztery sekwencje kodów kreskowych, badacze są w stanie skonstruować znakowane produkty cDNA poprzez odwrotną transkrypcję za pomocą enzymu BST. Termolabilna egzonukleaza I jest dodawana w celu strawienia nieprzereagowanych jednoniciowych starterów kodów kreskowych. Ponadto produkt dupleksowy cDNA-RNA jest trawiony przez RNazę H w celu uzyskania jednoniciowego cDNA (matryca ID). Połączoną mieszaninę matryc ID amplifikuje się w ten sam sposób, jak opisano w poprzedniej sekcji. Tylko te próbki z wirusem RNA będą generować dodatnie sygnały elektrochemiczne.

W tej części badacze wykorzystają RNA wirusa syntezy lub komercyjnie wyekstrahowany całkowity RNA wirusa jako matrycę do wykrywania. Wzbogacone próbki można wyśmiewać, mieszając je z ludzką śliną z głębokiego gardła lub wymazami z jamy nosowo-gardłowej pobranymi od zdrowych ochotników.

(iii) Wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego do integracji procesora próbek i modułu kodów kreskowych z etapem amplifikacji i detekcji kwasu nukleinowego do badań przesiewowych populacji na dużą skalę

W ramach tego projektu badacze projektują proste i łatwe w użyciu urządzenie przypominające długopis z mikroprzepływami, które integruje etapy przygotowania próbki, kodowania kreskowego oraz amplifikacji i wykrywania. Wykorzystuje napęd tłokowy, aby zapewnić moc wpychania próbki do różnych komór. Najpierw próbne próbki dodaje się do komory ładowania próbek, w której przechowywany jest bufor do lizy. Mieszanina surfaktyny, SDS i etanolu umożliwia szybką ekstrakcję wirusowego kwasu nukleinowego, który jest następnie wstrzykiwany do komory identyfikacyjnej zawierającej mieszaninę liofilizowanej polimerazy BST i startera ID-tag. Temperatura pozostanie na poziomie 37°C-50°C dla odwrotnej transkrypcji. Następnie próbka jest wstrzykiwana do komory zawierającej termolabilną egzonukleazę I. Następnie blok grzejny ustawia się na 65°C na 5 minut w celu dezaktywacji enzymu. Następnie cztery próbki są łączone razem i wstrzykiwane do elektrochemicznego chipa wykrywającego pod pisakiem mikroprzepływowym. Każdy chip zawiera cztery zestawy starterów i LP z różnymi elektroaktywnymi reporterami z nienakładającymi się potencjałami redoks, aby wywołać reakcję amplifikacji w obecności odpowiednich sekwencji ID uczestnika.

Komora detekcyjna znajduje się na szczycie wielokanałowej elektrochemicznej stacji roboczej, która składa się z portu łączącego czujnik elektrochemiczny z detektorem, płytki drukowanej i linii zasilającej do zewnętrznego wyświetlacza. Płytka drukowana składa się głównie z jednostki mikrokontrolera, przetwornika cyfrowo-analogowego i modułu potencjostatu, aby umożliwić różnicową analizę woltamperometrii impulsowej i jednoczesne uzyskiwanie sygnałów z szeregu elektrod, a tym samym wykrywanie łącznie 100 próbek.

(iv) Aby zweryfikować działanie prototypu przy użyciu próbki klinicznej i porównać ją z danymi wykrywającymi z dostępnego na rynku sprzętu testującego.

Proponowana metoda badania próbek zbiorczych zostanie porównana ze złotym standardem testu RT-PCR pod względem czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, negatywnej wartości predykcyjnej oraz dokładności. Po wykazaniu ważności wyników uzyskanych z proponowanej strategii łączenia badacze zbadają następnie możliwość wykorzystania próbek śliny i płynu z gardła zamiast wymazów z jamy nosowo-gardłowej. Pacjenci będą rekrutowani ze szpitala Prince of Wales w celu pobrania próbek oddechowych w celu określenia dokładności tego urządzenia.

A. Procedury studiowania

1. Dokumentacja medyczna uczestników w celu zebrania danych klinicznych, w tym wieku, płci, liczby dni od wystąpienia objawów, narażenia epidemiologicznego na osoby z potwierdzoną chorobą COVID-19, ciężkości (łagodna, umiarkowana, ciężka lub krytyczna) oraz obecności zostaną przeanalizowane choroby współistniejące.
2. Wyniki SARS-CoV-2 PCR uczestników ze szpitalnej dokumentacji elektronicznej zostaną pobrane.
3. Od każdego rekrutowanego pacjenta zostanie pobrany wymaz z jamy nosowo-gardłowej, ślina z głębokiego gardła i/lub próbka płynu do płukania jamy ustnej.

B. Procedury laboratoryjne i analizy danych

1. Przygotowanie próbki Próbki pobrane od 200 pacjentów zostaną najpierw podzielone na dwa zestawy o podobnej częstości występowania, a każdy rozmiar próbki to 100. Pierwszy zestaw 100 próbek zostanie wyekstrahowany przy użyciu komercyjnych zestawów do ekstrakcji wirusowego RNA dostarczonych przez HKUST, a następnie będzie przechowywany do dalszej analizy RT-qPCR i weryfikacji metody opartej na LAMP.
2. Test RT-qPCR W celu przygotowania wyniku RT-qPCR jako odniesienia, wyekstrahowane próbki z wyżej wymienionych zostaną przeanalizowane przy użyciu RT-qPCR w celu jakościowego i ilościowego wykrycia kwasu nukleinowego z SARS-CoV-2 oraz negatywnego, pozytywnego i należy dołączyć ślepą próbę kontrolną. Wartości progów cykli (Ct) oraz wyniki jakościowe i ilościowe każdej próbki zostaną zapisane. Po procedurach RT-qPCR będą stosowane istniejące wytyczne zalecane przez CDC. Zestawy starterów qPCR i sond Taqman oraz standardowe odniesienia RNA SARS-CoV-2 zostaną dostarczone przez HKUST.
3. Eksperymenty z próbkami zbiorczymi Drugi zestaw 100 inaktywowanych próbek zostanie losowo podzielony na 25 grup (każda po 4 próbki), a badacze przeprowadzą grupowe testy SARS-CoV-2 dla 25 pul przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego opracowanego powyżej z badaczami z HKUST. Na podstawie wyników RT-qPCR czułość, swoistość oraz dodatnie i ujemne wartości predykcyjne zostaną obliczone na potrzeby dalszej analizy danych przez HKUST.

Prowadzenie studiów

Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.