大規模な COVID-19 人口スクリーニング

宿主から宿主への迅速な感染と海外旅行の容易さが相まって、H5N1、H5N5、SARS、そして最近では COVID-19 パンデミックなどの流行を引き起こしています。 接触者の追跡や物理的な隔離などの従来の流行制御手段は、パンデミックの初期段階で病気の広がりを緩和するために最も重要であり、これらの戦略は、疑いのある患者を診断する正確さと速度に依存します。

現在、病原体検出のゴールド スタンダードは、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による核酸検出です。 ただし、この戦略は、ターンアラウンド タイム、高価な PCR マシン、潜在的な感染数によって制限されます。 したがって、他の等温増幅法は、余分な機器の必要性を回避し、検出手順全体を高速化するためによく使用されます。

感染症のスクリーニング効率を改善する 1 つのアプローチは、実行されるテストの総数を減らすために、サンプルを一緒にプールして同時にテストする、人気のある Dorfman テストです。 ただし、ドーフマン テストは有病率の低い集団に限定されており、感度が低下しています。プーリングサンプルテストを解決するために、バーコード戦略も導入されました。 2020 年、Schmid-Burk と彼の同僚は、LAMP とバーコードを組み合わせて、100,000 のプールされたサンプルから COVID-19 を開発することに成功しました。 しかし、高価な次世代シーケンサーが必要なため、その普及には限界があります。

メソッド

提案されたプラットフォームは、1 つのデバイスでの多段階プロセスの開発と、プールされたサンプルからの陽性シグナルのソースを識別する機能を目指しています。 提案された設計は、プール、等温増幅とシーケンス固有の電気化学的検出の組み合わせ、および 1 つの単純なデバイスでのいくつかのステップの統合の前に、検体の複数のソースにタグを付けるためのバーコード戦略を活用します。 研究プロジェクトの方法論は 3 つの部分に分けられます。

(i) 電気活性標識ループオリゴヌクレオチドプローブを用いた等温増幅法とリアルタイム検出法の開発

研究者は最近、研究者が米国の仮特許保護を申請した方法を概念化しました。 この新しい技術は、ループ媒介等温増幅 (LAMP) に基づいて、アンプリコンの等温増幅と電気化学的検出を同時に実行します。 提案されたスキームは、電気化学レポーターがプライマーの 1 つに結合され、増幅が発生した場合にのみレポーターを切断するためにニッキング酵素が追加されるワンポット増幅および検出システムを含みます。 1 回の反応で、テンプレート DNA は 2 対のプライマー結合部位を持つように設計されます。外側のフォワード プライマーとバックワード プライマーのペア (FP と BP) と内側のプライマー ペア、つまり電気化学的に標識されたループ プローブ (LP) とアシスタント プローブ (AP)。 FP と LP は二本鎖 DNA (dsDNA) テンプレートの同じ鎖に結合し、BP と AP は反対の鎖に結合します。 LP には、5' 末端に電気活性標識があり、ターゲット DNA 配列に相補的な 3' 突出セグメントがあります。 ステム領域にはニッキング酵素の認識配列が含まれていますが、ターゲット DNA が存在しないと切断されないように、最後のヌクレオチドにミスマッチが導入されています。 反応の開始は通常の LAMP と同様で、ダブルループアンプリコンが生成され、ダブルループ増幅段階に入ることができます。 ダブルループアンプリコンのそれぞれは、シグナル増幅ユニットとみなすことができる。 標識されたLPがアンプリコンと結合し、ニック酵素によって認識できる切断部位を形成すると、電気活性標識が放出され、電気化学信号が生成されます。 予備的な結果は、戦略が入力 DNA の約 10 コピー/μL に対応する最大 0.1 fg/μL を検出できることを示しています。 30分。 後続のステップには、RNA サンプルの検出のための逆転写ステップの組み込みと、実際の生体液を模倣する複雑なマトリックスでのシステムのテストが含まれます。

(ii) 4 つの個々のサンプルをバーコード化して一緒にプールし、プールされたサンプルから陽性の個人があればそれを同時に増幅および識別する分子戦略を設計すること。

4 つのバーコード シーケンスを設計することにより、研究者は BST 酵素による逆転写を介してタグ付き cDNA 製品を構築することができます。 熱不安定性エキソヌクレアーゼ I を加えて、未反応の一本鎖バーコード プライマーを消化します。 さらに、cDNA-RNA 二重鎖産物は RNase H によって消化され、一本鎖 cDNA (ID テンプレート) が生成されます。ID テンプレートのプールされた混合物は、前のセクションで説明したのと同じプロセスで増幅されます。 RNA ウイルスを含むサンプルのみが正の電気化学シグナルを生成します。

この部分では、研究者は合成ウイルス RNA または市販の抽出ウイルスの全 RNA を検出テンプレートとして使用します。 スパイクされたサンプルは、健康なボランティアからの人間の喉の奥の唾液または鼻咽頭スワブと混合することによって嘲笑することができます。

(iii) マイクロ流体デバイスを製造して、サンプル プロセッサとバーコード モジュールを、大規模な人口スクリーニングのための核酸増幅および検出ステップと統合する

このプロジェクトでは、調査員は、サンプル調製、バーコード、増幅と検出のステップを統合する、シンプルで使いやすいマイクロ流体ペンのようなデバイスを設計します。 ピストン推進力を使用して、サンプルをさまざまなチャンバーに押し込む力を提供します。 最初に、模擬サンプルは、溶解バッファーが格納されているサンプル ローディング チャンバーに追加されます。 サーファクチン、SDS、およびエタノールの混合物は、ウイルス核酸の迅速な抽出を可能にし、凍結乾燥された BST ポリメラーゼと ID タグ プライマー混合物を含む識別チャンバーに注入されます。 温度は、逆転写のために 37 °C ～ 50 °C に維持されます。 次に、サンプルは不耐熱性エキソヌクレアーゼ I を含むチャンバーに注入されます。 加熱ブロックは、酵素を非アクティブ化する 5 分間 65 ° C に設定されます。 その後、4 つのサンプルが一緒にプールされ、マイクロ流体ペンの下の電気化学検出チップに注入されます。 各チップには、それぞれの参加者の ID シーケンスの存在下で増幅反応をトリガーする重複しない酸化還元電位を持つ異なる電気活性レポーターを持つ 4 セットのプライマーと LP が含まれています。

検出チャンバーは、電気化学センサーと検出器の間の接続ポート、回路基板、および外部ディスプレイ用の電力線で構成されるマルチチャンネル電気化学ワークステーションの上にあります。 回路基板は主に、マイクロコントローラー ユニット、デジタル/アナログ コンバーター、ポテンショスタット モジュールで構成され、微分パルス ボルタンメトリー分析を可能にし、同時に電極アレイから信号を取得し、合計 100 サンプルを検出します。

(iv) 臨床検体を使用してプロトタイプの性能を検証し、市販の試験装置からの検出データに対してベンチマークします。

プールされたサンプル テストの提案された方法は、感度、特異性、陽性適中率、陰性適中率、および精度の観点から、ゴールド スタンダード RT-PCR テストと比較されます。 提案されたプーリング戦略から得られた結果の妥当性を実証した後、研究者は鼻咽頭スワブの代わりに唾液と口内うがいサンプルを使用する可能性を探ります。 プリンス オブ ウェールズ病院から患者を募集し、この装置の精度を判断するための呼吸器サンプルを収集します。

A. 研究手順

1. 参加者の医療記録は、年齢、性別、症状の発症からの日数、COVID-19 疾患が確認された人々への疫学的暴露、重症度 (軽度、中等度、重度、または重度)、および併存症が見直されます。
2. 病院の電子記録から参加者の SARS-CoV-2 PCR 結果が取得されます。
3. リクルートされた各患者から、鼻咽頭スワブ、ディープスロート唾液、および/または口内うがいサンプルが収集されます。

B. 検査手順とデータ分析

1. サンプルの準備 200 人の患者から収集されたサンプルは、最初に同様の有病率を持つ 2 つのセットに分割され、各サンプル サイズは 100 です。 最初のセット 100 サンプルは、HKUST が提供する市販のウイルス RNA 抽出キットを使用して抽出され、さらに RT-qPCR 分析と LAMP ベースのメソッド検証のために保存されます。
2. RT-qPCR アッセイ リファレンスとして RT-qPCR の結果を準備するために、上記の抽出サンプルを RT-qPCR を使用して分析し、SARS-CoV-2 由来の核酸の定性的および定量的検出、および陰性、陽性空白の対照実験を含める必要があります。 各サンプルのサイクル閾値 (Ct) 値、定性的および定量的結果が記録されます。 RT-qPCR 手順は、既存の CDC 推奨ガイドラインに従います。 qPCR プライマーと Taqman プローブ セット、および SARS-CoV-2 RNA 標準リファレンスは、HKUST から提供されます。
3. プールされたサンプル実験 2 番目のセット 100 の不活化サンプルはランダムに 25 のグループに分けられ (それぞれ 4 つのサンプル)、研究者は HKUST の研究者と上記で開発されたマイクロ流体デバイスを使用して、25 のプールに対して SARS-CoV-2 グループテストを実行します。 RT-qPCR の結果に基づいて、HKUST によるさらなるデータ分析のために、感度、特異性、陽性および陰性の予測値が計算されます。

試験実施

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されます。