Rozsáhlý populační screening COVID-19

Rychlé přenosy mezi hostiteli ve spojení se snadným mezinárodním cestováním vedly k epidemiím, jako je H5N1, H5N5, SARS a v poslední době pandemie COVID-19. Tradiční opatření pro kontrolu epidemie, jako je sledování kontaktů a fyzická izolace, jsou zásadní pro zmírnění rozsahu šíření onemocnění v rané fázi pandemie a tyto strategie závisí na přesnosti a rychlosti diagnostiky podezřelých pacientů.

Nyní je zlatým standardem pro detekci patogenů detekce nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato strategie je však omezena dobou obrátky, nákladným PCR strojem a potenciálním počtem infekcí. Proto se často používají jiné metody izotermické amplifikace k obejití potřeby dalšího přístrojového vybavení a urychlení celého postupu detekce.

Jedním z přístupů ke zlepšení účinnosti screeningu infekčních chorob je oblíbené Dorfmanovo testování, kdy se vzorky spojují a testují současně, aby se snížil celkový počet provedených testů. Dorfmanovo testování je však omezeno na populaci s nízkou prevalencí a má sníženou citlivost; Byla také zavedena strategie čárových kódů pro řešení testu sdružování vzorků. V roce 2020 Schmid-Burk a jeho kolegové zkombinovali LAMP a čárové kódy, čímž úspěšně vyvinuli COVID-19 ze 100 000 shromážděných vzorků. Potřeba drahého sekvenceru nové generace však omezuje jeho široké použití.

Metody

Navržená platforma se zaměřuje na vývoj vícekrokového procesu v jednom zařízení a na schopnost identifikace zdroje pozitivních signálů ze sdružených vzorků. Navrhovaný návrh bude využívat strategii čárových kódů k označení více zdrojů analytů před sloučením, kombinaci izotermické amplifikace a sekvenčně specifické elektrochemické detekce a integraci několika kroků do jednoho jednoduchého zařízení. Metodika výzkumného projektu bude rozdělena do tří částí.

(i) Vyvinout metodu izotermické amplifikace a detekci v reálném čase pomocí elektroaktivně značených smyčkových oligonukleotidových sond

Vyšetřovatelé nedávno konceptualizovali metodu, na kterou vyšetřovatelé podali americkou prozatímní patentovou ochranu. Tato nová technika provádí izotermickou amplifikaci a elektrochemickou detekci amplikonů současně na základě smyčky zprostředkované izotermické amplifikace (LAMP). Navrhované schéma zahrnuje amplifikační a detekční systém v jedné nádobě, ve kterém je elektrochemický reportér připojen k jednomu z primerů a přidává se štěpící enzym, který odštěpí reportér pouze tehdy, když dojde k amplifikaci. V jedné reakci je templátová DNA navržena tak, aby měla dva páry vazebných míst pro primer: vnější pár dopředných a zpětných primerů (FP a BP) a vnitřní pár primerů, jmenovitě elektrochemicky značenou smyčkovou sondu (LP) a asistenční sonda (AP). FP a LP se vážou na stejný řetězec templátu dvouřetězcové DNA (dsDNA), zatímco BP a AP se vážou na opačný řetězec. LP obsahuje elektroaktivní značku na 5' konci a 3' přesahující segment komplementární k cílové sekvenci DNA. Kmenová oblast obsahuje rozpoznávací sekvenci štěpícího enzymu, ale do posledního nukleotidu se zavede chybné párování, takže nebude štěpeno bez přítomnosti cílové DNA. Začátek reakce je podobný běžné LAMP, lze vyrobit amplikon s dvojitou smyčkou a reakce může přejít do fáze amplifikace s dvojitou smyčkou. Každý ze dvousmyčkových amplikonů lze považovat za jednotku zesilování signálu. Jakmile se značený LP zkombinuje s amplikonem a vytvoří místo štěpení, které může být rozpoznáno enzymem nick, může se uvolnit elektroaktivní značka a bude generován elektrochemický signál. Předběžné výsledky naznačují, že strategie je schopna detekovat až 0,1 fg/μl, což odpovídá přibližně 10 kopiím/μl vstupní DNA, za použití elektroaktivního reportéru methylenové modři na čtyřřadých sítotiskových uhlíkových elektrodách (SPCE). 30 min. Následující kroky zahrnují začlenění kroku reverzní transkripce pro detekci vzorků RNA a testování systému v komplexních matricích pro napodobení skutečných biologických tekutin.

(ii) Navrhnout molekulární strategii pro čárové kódování čtyř jednotlivých vzorků tak, aby mohly být spojeny dohromady, a současně amplifikovat a identifikovat pozitivního jedince, pokud existuje, ze spojeného vzorku.

Navrhnutím čtyř sekvencí čárového kódu jsou výzkumníci schopni zkonstruovat značené cDNA produkty prostřednictvím reverzní transkripce enzymem BST. Termolabilní exonukleáza I je přidána ke štěpení nezreagovaných jednořetězcových primerů čárového kódu. Kromě toho je duplexní produkt cDNA-RNA štěpen RNázou H za vzniku jednořetězcové cDNA (ID-templát). Shromážděná směs ID-templátů je amplifikována pomocí stejného procesu popsaného v předchozí části. Pouze vzorky s RNA virem budou generovat pozitivní elektrochemické signály.

V této části budou vyšetřovatelé používat syntézní virovou RNA nebo komerčně extrahovanou virovou celkovou RNA jako detekční šablonu. Vzorky s přídavkem lze zesměšnit smícháním s lidskými hlubokými slinami v krku nebo výtěry z nosohltanu od zdravých dobrovolníků.

(iii) Výroba mikrofluidního zařízení pro integraci procesoru vzorků a modulu čárového kódu s krokem amplifikace a detekce nukleové kyseliny pro screening populace ve velkém měřítku

V tomto projektu vyšetřovatelé navrhují jednoduché a snadno použitelné mikrofluidní zařízení podobné peru, které integruje kroky přípravy vzorku, čárového kódování, amplifikace a detekce. Využívá pístový pohon, který poskytuje energii k tlačení vzorku do různých komor. Nejprve jsou falešné vzorky přidány do komory pro vkládání vzorků, kde je uložen lyzační pufr. Směs surfaktinu, SDS a ethanolu umožňuje rychlou extrakci virové nukleové kyseliny, která je poté injikována dolů do identifikační komory obsahující lyofilizovanou polymerázu BST a směs primerů ID-tag. Teplota zůstane na 37 °C-50 °C pro reverzní transkripci. Poté se vzorek vstříkne do komory obsahující termolabilní exonukleázu I. Zahřívací blok se poté nastaví na 65 °C na 5 minut, aby se enzym deaktivoval. Poté se čtyři vzorky spojí dohromady a vstříknou se do elektrochemického detekčního čipu pod mikrofluidním perem. Každý čip obsahuje čtyři sady primerů a LP s různými elektroaktivními reportéry s nepřekrývajícími se redox potenciály pro spuštění amplifikační reakce v přítomnosti příslušných ID sekvencí účastníka.

Detekční komora je umístěna na vícekanálové elektrochemické pracovní stanici, která se skládá z propojovacího portu mezi elektrochemickým senzorem a detektorem, obvodové desky a napájecího vedení pro externí displej. Deska plošných spojů se skládá hlavně z jednotky mikrokontroléru, digitálně-analogového převodníku a modulu potenciostatu, který umožňuje analýzu diferenciální pulzní voltametrie a současně získává signály z pole elektrod, a tím detekuje celkem 100 vzorků.

(iv) Validovat výkonnost prototypu pomocí klinického vzorku a porovnat jej s detekčními údaji z komerčně dostupného testovacího zařízení.

Navrhovaná metoda testování sdružených vzorků bude porovnána s testem zlatého standardu RT-PCR z hlediska senzitivity, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty, negativní prediktivní hodnoty a přesnosti. Po prokázání platnosti výsledků získaných z navrhované strategie sdružování pak výzkumníci prozkoumají možnost použití vzorků slin a ústního kloktadla místo výtěrů z nosohltanu. Pacienti budou rekrutováni z nemocnice Prince of Wales Hospital pro odběr vzorků dýchacích cest, aby se zjistila přesnost tohoto zařízení.

A. Studijní postupy

1. Zdravotní záznamy účastníků za účelem shromažďování klinických údajů, včetně věku, pohlaví, počtu dní po nástupu příznaků, epidemiologické expozice lidem s potvrzeným onemocněním COVID-19, závažnosti (mírné, střední, těžké nebo kritické) a přítomnosti komorbidity budou přezkoumány.
2. Výsledky SARS-CoV-2 PCR účastníků z nemocničního elektronického záznamu budou načteny.
3. Od každého přijatého pacienta bude odebrán vzorek nosohltanového výtěru, hlubokých slin z krku a/nebo kloktadla.

B. Laboratorní postupy a analýzy dat

1. Příprava vzorků Vzorky odebrané od 200 pacientů budou nejprve rozděleny do dvou souborů s podobnou prevalencí a velikost každého vzorku je 100. První sada 100 vzorků bude extrahována pomocí komerčních souprav pro extrakci virové RNA od HKUST a poté budou uloženy pro další analýzu RT-qPCR a ověření metody založené na LAMP.
2. Test RT-qPCR Pro přípravu výsledku RT-qPCR jako referenčního budou extrahované vzorky z výše uvedeného analyzovány pomocí RT-qPCR pro kvalitativní a kvantitativní detekci nukleové kyseliny z SARS-CoV-2 a negativní, pozitivní a měl by být zahrnut slepý kontrolní experiment. Budou zaznamenány hodnoty prahových hodnot cyklu (Ct), kvalitativní a kvantitativní výsledky každého vzorku. Postupy RT-qPCR budou následovat stávající pokyny doporučené CDC. Sady primerů qPCR a sond Taqman a standardní reference SARS-CoV-2 RNA poskytne HKUST.
3. Experimenty se sdruženými vzorky Druhá sada 100 inaktivovaných vzorků bude náhodně rozdělena do 25 skupin (každá pro 4 vzorky) a vyšetřovatelé provedou skupinové testování SARS-CoV-2 pro 25 skupin pomocí mikrofluidního zařízení vyvinutého výše s výzkumníky HKUST. Na základě výsledků RT-qPCR budou pomocí HKUST vypočteny citlivost, specificita a pozitivní a negativní prediktivní hodnoty pro další analýzu dat.

Vedení studia

Tato studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací.