Grootschalig Bevolkingsonderzoek COVID-19

Snelle host-to-host-transmissies in combinatie met het gemak van internationaal reizen hebben geleid tot epidemieën zoals H5N1, H5N5, SARS en, meest recentelijk, de COVID-19-pandemie. Traditionele epidemische controlemaatregelen, zoals het opsporen van contacten en fysieke isolatie, zijn van het grootste belang om de verspreiding van de ziekte in een vroeg stadium van de pandemie te beperken en deze strategieën zijn afhankelijk van de nauwkeurigheid en snelheid van het diagnosticeren van verdachte patiënten.

Nu is de gouden standaard voor de detectie van pathogenen nucleïnezuurdetectie via polymerasekettingreactie (PCR). Deze strategie wordt echter beperkt door de doorlooptijd, de dure PCR-machine en het potentiële aantal infecties. Daarom worden vaak andere isotherme versterkingsmethoden gebruikt om de behoefte aan extra instrumentatie te omzeilen en de hele detectieprocedure te versnellen.

Een manier om de efficiëntie van de screening op infectieziekten te verbeteren, is de populaire Dorfman-test, waarbij monsters worden samengevoegd en tegelijkertijd worden getest om het totale aantal uitgevoerde tests te verminderen. De Dorfman-test is echter beperkt tot een populatie met een lage prevalentie en heeft een verminderde gevoeligheid; Er is ook een streepjescodestrategie geïntroduceerd om de pooling-steekproeftest op te lossen. In 2020 combineerden Schmid-Burk en zijn collega's LAMP en barcodering, waardoor COVID-19 met succes werd ontwikkeld op basis van 100.000 samengevoegde monsters. De behoefte aan een dure sequencer van de volgende generatie beperkt echter het wijdverbreide gebruik ervan.

methoden

Het voorgestelde platform is gericht op de ontwikkeling van een meerstapsproces in één apparaat en het vermogen om de bron van positieve signalen uit gepoolde monsters te identificeren. Het voorgestelde ontwerp maakt gebruik van een barcodestrategie om meerdere bronnen van analyten te taggen voorafgaand aan pooling, een combinatie van isothermische amplificatie en sequentiespecifieke elektrochemische detectie, en de integratie van verschillende stappen in één eenvoudig apparaat. De methodologie van het onderzoeksproject zal in drie delen worden verdeeld.

(i) Het ontwikkelen van een isotherme amplificatiemethode en real-time detectie met behulp van elektroactief gelabelde loop-oligonucleotideprobes

De onderzoekers hebben onlangs een methode geconceptualiseerd, waarvoor de onderzoekers een Amerikaanse voorlopige octrooibescherming hebben aangevraagd. Deze nieuwe techniek voert de isotherme amplificatie en elektrochemische detectie van amplicons tegelijkertijd uit op basis van Loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Het voorgestelde schema omvat een amplificatie- en detectiesysteem in één pot waarin een elektrochemische reporter aan een van de primers is bevestigd en een nicking-enzym wordt toegevoegd om de reporter alleen te splitsen wanneer amplificatie plaatsvindt. In één reactie wordt een template-DNA zo ontworpen dat het twee paar primerbindingsplaatsen heeft: een buitenste paar voorwaartse en achterwaartse primers (FP en BP) en een binnenste paar primers, namelijk een elektrochemisch gelabelde lusprobe (LP) en een assistent sonde (AP). De FP en LP binden aan dezelfde streng van de dubbelstrengige DNA-template (dsDNA), terwijl de BP en AP binden aan de tegenovergestelde streng. De LP bevat een elektroactief label aan het 5'-uiteinde en een 3'-overhangend segment dat complementair is aan de doel-DNA-sequentie. Het stamgebied bevat de herkenningssequentie van een nicking-enzym, maar er wordt een mismatch geïntroduceerd in het laatste nucleotide zodat het niet wordt gesplitst zonder de aanwezigheid van het doel-DNA. De start van de reactie is vergelijkbaar met gewone LAMP, een amplicon met dubbele lus kan worden geproduceerd en de reactie kan in de fase van amplificatie met dubbele lus komen. Elk van de versterkers met dubbele lus kan worden beschouwd als een signaalversterkingseenheid. Zodra de gelabelde LP is gecombineerd met het amplicon en een splitsingsplaats vormt die kan worden herkend door het nick-enzym, kan een elektroactief label worden vrijgegeven en zal een elektrochemisch signaal worden gegenereerd. De voorlopige resultaten geven aan dat de strategie in staat is om tot 0,1 fg/μL te detecteren, overeenkomend met ongeveer 10 kopieën/μL van het ingevoerde DNA, door een methyleenblauwe elektroactieve reporter te gebruiken op vier-array gezeefdrukte koolstofelektroden (SPCE's) binnen 30 minuten. De daaropvolgende stappen omvatten het opnemen van een omgekeerde transcriptiestap voor de detectie van RNA-monsters en het testen van het systeem in complexe matrices om werkelijke biologische vloeistoffen na te bootsen.

(ii) Een moleculaire strategie ontwerpen om vier individuele monsters te barcoderen zodat ze kunnen worden samengevoegd en tegelijkertijd het positieve individu, indien aanwezig, uit het samengevoegde monster te versterken en te identificeren.

Door vier streepjescodesequenties te ontwerpen, zijn de onderzoekers in staat om gelabelde cDNA-producten te construeren door middel van reverse transcriptie door BST-enzym. Thermolabiel exonuclease I wordt toegevoegd om niet-gereageerde enkelstrengs barcodeprimers te verteren. Bovendien wordt het cDNA-RNA-duplexproduct gedigereerd door RNase H om een ​​enkelstrengs cDNA (ID-template) op te leveren. Het gepoolde mengsel van ID-templates wordt geamplificeerd via hetzelfde proces als beschreven in de vorige paragraaf. Alleen die monsters met het RNA-virus zullen positieve elektrochemische signalen genereren.

In dit deel gebruiken de onderzoekers synthesevirus-RNA of commercieel geëxtraheerd virustotaal-RNA als detectietemplate. De verrijkte monsters kunnen worden bespot door ze te mengen met menselijk keelspeeksel of nasofaryngeale uitstrijkjes van gezonde vrijwilligers.

(iii) Een microfluïdisch apparaat fabriceren om de monsterprocessor en barcodemodule te integreren met de nucleïnezuuramplificatie en detectiestap voor grootschalige bevolkingsonderzoek

In dit project ontwerpen de onderzoekers een eenvoudig en gebruiksvriendelijk microfluïdisch penachtig apparaat dat de stappen van monstervoorbereiding, streepjescode en amplificatie en detectie integreert. Het maakt gebruik van zuigeraandrijving om kracht te leveren om het monster in verschillende kamers te duwen. Eerst worden de nepmonsters toegevoegd aan een monsterlaadkamer waar de lysisbuffer wordt opgeslagen. Een mengsel van surfactine, SDS en ethanol maakt de snelle extractie van viraal nucleïnezuur mogelijk, dat vervolgens wordt geïnjecteerd in de identificatiekamer die het gevriesdroogde BST-polymerase- en ID-tag-primermengsel bevat. De temperatuur blijft op 37 °C-50 °C voor reverse transcriptie. Vervolgens wordt het monster geïnjecteerd in de kamer die thermolabiel exonuclease I bevat. Het verwarmingsblok wordt vervolgens gedurende 5 minuten op 65 °C ingesteld om het enzym te deactiveren. Daarna worden de vier monsters samengevoegd en geïnjecteerd in een elektrochemische detectiechip onder de microfluïdische pen. Elke chip bevat vier sets primers en LP's met verschillende elektroactieve reporters met niet-overlappende redoxpotentialen om de amplificatiereactie te activeren in aanwezigheid van de ID-sequenties van de respectieve deelnemers.

De detectiekamer bevindt zich bovenop een meerkanaals elektrochemisch werkstation, dat bestaat uit een verbindingspoort tussen de elektrochemische sensor en detector, een printplaat en een voedingskabel voor een extern beeldscherm. De printplaat bestaat voornamelijk uit een microcontroller-eenheid, een digitaal-naar-analoog-omzetter en een potentiostaatmodule om differentiële pulsvoltametrie-analyse mogelijk te maken en tegelijkertijd de signalen van een reeks elektroden te verkrijgen en daardoor in totaal 100 monsters te detecteren.

(iv) De prestaties van het prototype valideren met behulp van een klinisch monster en het vergelijken met de detectiegegevens van in de handel verkrijgbare testapparatuur.

De voorgestelde methode van het testen van gepoolde monsters zal worden vergeleken met de gouden standaard RT-PCR-test in termen van gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde, negatief voorspellende waarde en nauwkeurigheid. Nadat de validiteit van de resultaten van de voorgestelde poolingstrategie is aangetoond, zullen de onderzoekers de mogelijkheid onderzoeken om speeksel- en mondgorgelmonsters te gebruiken in plaats van de nasofaryngeale uitstrijkjes. Patiënten zullen worden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital voor het verzamelen van ademhalingsmonsters om de nauwkeurigheid van dit apparaat te bepalen.

A. Studieprocedures

1. Medische dossiers van deelnemers om klinische gegevens te verzamelen, waaronder leeftijd, geslacht, aantal dagen na het begin van de symptomen, epidemiologische blootstelling aan mensen met bevestigde COVID-19-ziekte, ernst (licht, matig, ernstig of kritiek) en de aanwezigheid van comorbiditeit zal worden beoordeeld.
2. SARS-CoV-2 PCR-resultaten van de deelnemers uit het elektronische ziekenhuisdossier worden opgehaald.
3. Nasofaryngeaal uitstrijkje, keelspeeksel en/of mondgorgelmonster van elke gerekruteerde patiënt zal worden verzameld.

B. Laboratoriumprocedures en gegevensanalyses

1. Monstervoorbereiding De monsters die van de 200 patiënten zijn verzameld, worden eerst verdeeld over twee sets met een vergelijkbare prevalentie, en elke steekproefgrootte is 100. De eerste set van 100 monsters zal worden geëxtraheerd met behulp van commerciële virale RNA-extractiekits van HKUST, en vervolgens worden opgeslagen voor verdere RT-qPCR-analyse en de LAMP-gebaseerde methodeverificatie.
2. RT-qPCR-assay Om het RT-qPCR-resultaat als referentie voor te bereiden, zullen de geëxtraheerde monsters van bovengenoemde monsters worden geanalyseerd met behulp van RT-qPCR voor de kwalitatieve en kwantitatieve detectie van nucleïnezuur van SARS-CoV-2, en een negatief, een positief en een blanco controle-experiment moet worden opgenomen. De waarden van de cyclusdrempels (Ct), kwalitatieve en kwantitatieve resultaten van elk monster worden geregistreerd. De RT-qPCR-procedures zullen worden gevolgd door bestaande door de CDC aanbevolen richtlijnen. De qPCR-primer- en Taqman-sondesets en de SARS-CoV-2 RNA-standaardreferentie worden geleverd door HKUST.
3. Gepoolde monsterexperimenten De tweede set van 100 geïnactiveerde monsters zal willekeurig worden verdeeld in 25 groepen (elk voor 4 monsters), en de onderzoekers zullen SARS-CoV-2-groepstests uitvoeren voor de 25 pools met behulp van het microfluïdische apparaat dat hierboven is ontwikkeld met HKUST-onderzoekers. Op basis van de RT-qPCR-resultaten worden de gevoeligheid, specificiteit en positieve en negatieve voorspellende waarden berekend voor verdere gegevensanalyse door HKUST.

Studie gedrag

Deze studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.