Perioperatív ráksejtek disszeminációja és szisztémás immunszuppresszió reszekálható ductalis hasnyálmirigy-adenokarcinómában

A keringő rákos sejtek és az immunszuppresszió prognosztikai jelentősége reszekálható hasnyálmirigy karcinómában

1. Bevezetés

   A hasnyálmirigy-adenokarcinóma a negyedik leggyakoribb rák okozta halálok férfiak és nők körében, az 5 éves túlélés a betegség minden szakaszában kevesebb, mint 5%. A hasnyálmirigyrák halálozási aránya rendkívül magas, és gyakorlatilag megegyezik az új esetek számával (Egészségügyi Világszervezet. Világ rákjelentés. Lyon: IACR Press; 2003). A legtöbb hasnyálmirigyrákos beteget előrehaladott stádiumban diagnosztizálják, és átlagos túlélésük 4-10 hónap, a betegség mértékétől és a kezelési módtól függetlenül. Összességében a betegek kevesebb mint 5%-ánál végeznek reszekciót gyógyító szándékkal, bár több mint 80%-uknál kiújul a rák (Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin 2002; 52, 23-47). A hasnyálmirigyrákos betegeknél az áttétes betegség elsődleges helye a máj és/vagy a peritoneális üreg.

   A rák kiújulása többtényezős, és a beteggel, daganattal és műtéttel kapcsolatos tényezők határozzák meg. Számos olyan mechanizmus kombinációját javasolták, amelyek révén a rák kiújulhat a potenciálisan gyógyító reszekciót követően (Coffey JC, Wang JH, Smith MJF, Bouchier-Hayes D, Cotter TG és Redmond HP). Excíziós műtét a rák gyógyítására: terápia költséggel. Lancet Oncol 2003;4:760-68). A műtét hozzájárulhat a teljes maradék tumorterheléshez azáltal, hogy a tumor manipulációja során disszeminált rákos sejteket ad hozzá. A posztoperatív immunszuppresszió következtében a beteg fogékonyabbá válhat a daganatképződésre, és/vagy a disszeminált rákos sejtek könnyebben kikerülhetnek az immunválaszból. Végül, a sebészeti reszekció megváltoztathatja a rákos sejtek biológiai tulajdonságait, és fokozott sejtproliferációhoz és csökkent sejthalálhoz vezethet.

2. A rákos sejtek terjesztése

   Hiányoznak a szilárd markerek a rák kiújulásának vagy progressziójának előrejelzésére, mielőtt a hagyományos vagy modern diagnosztikai képalkotással mérhetőek lennének. A molekuláris technikák, mint például a reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR) technika rendkívül érzékeny módszernek és hatékony eszköznek bizonyultak a rákáttétek vizsgálatában (Raj GV, Moreno JG, Gomella LG). Polimeráz láncreakciós technológia alkalmazása szilárd daganatok kimutatásában. Rák 1998; 82, 1419-1442). A keringő rákos sejtek prognosztikai jelentőségét hasnyálmirigyrákos betegekben alig vizsgálják. Az emlőrákos betegeknél az EpCAM-ot (epiteliális sejt adhéziós molekulát) expresszáló keringő rákos sejtek száma a progressziómentes és a teljes túlélés független előrejelzőjének bizonyult (Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, Hayes DF. Keringő daganatsejtek, a betegség progressziója és túlélése áttétes emlőrákban. N Engl J Med 2004; 351, 781-91). Az EpCAM a legtöbb hámsejt-daganatban jelen lévő marker, és gyakran túlzottan expresszálódik primer és metasztatikus adenokarcinómában, beleértve a hasnyálmirigyrákot (Rao CG, Chianese D, Doyle GV, Miller MC, Russell T, Sanders RA Jr, Terstappen LW). Hámsejt adhéziós molekula expressziója a vérben jelenlévő karcinóma sejtekben és primer és metasztatikus daganatokban. Int J Oncol 2005; 27, 49-57). Ezenkívül más markereket, például CEA-t, CK20-at, K-ras-t használtak a disszeminált hasnyálmirigyráksejtek kimutatására. A kolorektális karcinómában szenvedő betegeknél a perifériás vagy mesenterialis vénás vérben RT-PCR-rel kimutatott rákos sejtek prognosztikai tényezőnek tűnnek (Yamaguchi K, Takagi Y, Aoki S, Futamura M, Saji S). A vérben keringő rákos sejtek jelentős kimutatása reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval kolorektális rák reszekció során. Ann Surg 2000; 232, 58-65. Guller U, Zajac P, Schnider A, Bösch B, Vorburger S, Zuber M, Spagnoli GC, Oertli D, Maurer R, Metzger U, Harder F, Heberer M, Marti WR. A valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakcióval kimutatott, elterjedt tumorsejtek prognosztikai tényezőt jelentenek a vastag- és végbélrák miatt műtéten átesett betegeknél. Ann Surg 2002; 236, 768-76).

3. A metasztatikus rákos sejtek molekuláris jellemzői

   A metasztázis kialakulása rendkívül szelektív folyamat, amely a metasztatikus sejtek egy kisebb szubpopulációjának túlélését segíti elő. A metasztázisok előállításához az ebből az alpopulációból származó tumorsejteknek egymáshoz kapcsolódó lépések sorozatát kell végrehajtaniuk. A klinikailag releváns távoli metasztázisok előállításához a sikeres áttétes sejtnek összetett fenotípust kell mutatnia, amelyet átmeneti vagy állandó génszintű változások szabályoznak. Sok rosszindulatú daganat, beleértve a hasnyálmirigyrákot is, heterogén sejtalpopulációkat tartalmaz. Ez a heterogenitás a genetikai, biokémiai, immunológiai és biológiai jellemzők széles skálájában mutatkozik meg, mint például a növekedési sebesség, az antigén és immunogén állapot, a sejtfelszíni receptorok és termékek, az enzimek, a kariotípusok, a sejtmorfológiák, az invazivitás, a gyógyszerrezisztencia és a metasztatikus potenciál. Valószínű, hogy a nagyobb heterogén tumormintában lévő specifikus tumorsejtek vagy kolóniák a távoli áttétek előfutárai. Maga az egész metasztatikus folyamat általános hatékonysága alacsony. Bár az emberekben a metasztázishoz szükséges rákos sejtek abszolút száma nem ismert, a keringő rákos sejtek száma és a metasztázisok későbbi kialakulása közötti pozitív kapcsolat számos kísérleti tanulmány tárgya (Fisher, E. R. és Fisher, B. Experimental study) a keringő tumorsejtekből származó májmetasztázisok kialakulását befolyásoló tényezők. Acta Cytol. 9, 146-159 (1965)]. Fidler, I.J. Az embolia homogenitásának, számának, méretének és életképességének kapcsolata a kísérleti metasztázisok előfordulásával. Europ. J. Cancer 9, 223-227, 1973. Liotta, L.A., Kleinerman, J., Saidel, G. Az intravaszkuláris tumorsejtek, a tumorerek és a tüdőmetasztázis kvantitatív kapcsolatai. Cancer Res. 34, 977-1004 (1974)]. Weiss, L., Mayhew, E., Glaves, R.P. és Holmes, J.C. Metastatic inefficiency in mice in bearing B16 melanoma. Br. J. Cancer 45, 44-53, 1982. Topal B, Aerts JL, Roskams T, Fieuws S, Van Pelt J, Vandekerckhove P, Penninckx F. Cancer cell dissemination during curative surgery for colorectal liver metastases. Eur J Surg Oncol 2005; 31, 506-511).

   A hasnyálmirigyrák rossz prognózisa és hatékony kezelésének hiánya számos okból adódik. Jelenleg nem állnak rendelkezésre olyan hatékony biomarkerek, amelyek alkalmasak a hasnyálmirigyrák korai felismerésére, amely hajlamos gyorsan behatolni a környező struktúrákba, és korai metasztatikus terjedésen megy keresztül. Ezenkívül a hasnyálmirigyrák rendkívül ellenálló mind a kemoterápiával, mind a sugárterápiával szemben. Jelenleg ezeknek a jellemzőknek a molekuláris alapja nem ismert. A génexpressziós profilok fontos információkat szolgáltatnak a rákok molekuláris jellemzőiről, és felhasználhatók a szorosan kapcsolódó rák altípusok megkülönböztetésére. A génprofilozás felhasználható biomarkerjelölt kifejlesztésére és a tumorbiológia specifikus funkcionális aspektusaiban szerepet játszó géncsoportok azonosítására is. A hasnyálmirigy-daganatok, a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás és a normál hasnyálmirigyszövet között megkülönböztethető génexpressziós profilokat széles körben tanulmányozták különböző microarray-ek és microarray-platformok segítségével. A hasnyálmirigy-tumorszövetekben eltérően expresszált gének meglehetősen specifikusak és nagymértékben reprodukálhatóak a platformok és tanulmányok között (Crnogorac-Jurcevic T, Efthimiou E, Nielsen T, Loader J, Terris B, Stamp G, Baron A, Scarpa A és Lemoine NR . Mikrodisszekált hasnyálmirigy-adenokarcinómák expressziós profilja. Onkogén 2002; 21, 4587-4594. Han H, Bearss DJ, Browne LW, Calaluce R, Naagle RB, Von Hoff DD. Differenciálisan expresszált gének azonosítása hasnyálmirigyrák sejtekben cDNS microarray segítségével. Cancer Res 2002; 62, 2890-96 (1996)]. Iacobuzio-Donahue CA, Ashfaq R, Maitra A, Adsay NV, Shen-Ong GL, Berg K, Hollingsworth MA, Cameron JL, Yeo CJ, Kern SE, Goggins M, Hruban RH. Cancer Res 2003; 63, 8614-22. Logsdon CD, Simeone DM, Binkley C, Arumugam T, Greenson JK, Giordano TJ, Misek DE, Hanash S. A pancreas adenocarcinoma és krónikus pancreatitis molekuláris profilozása azonosítja a hasnyálmirigyrákban eltérően szabályozott géneket. Cancer Res 2003; 63: 2649-57).

4. Perioperatív immunológiai változások

   Az immunrendszer elnyomása a posztoperatív stresszválasz jellemzője, amelyben a természetes gyilkos (NK) és limfocita aktivált ölő (LAK) sejtek az immun tumorellenes felügyelet szerves részét képezik. Hiányzik azonban a daganattípus-specifikus immunreakció hasnyálmirigyrákban vagy műtéten átesett betegeknél. Az NK- és LAK-sejtek daganatellenes aktivitása közvetlenül a műtét után csökken, így a műtét additív hatásai elegendőek lehetnek ahhoz, hogy javítsák a disszeminált rákos sejtek azon képességét, hogy elkerüljék a gazdaszervezet immunválaszát elég hosszú ideig ahhoz, hogy áttétek alakuljanak ki (Da Costa ML, Finnegan N , Flynn M, Bouchier-Hayes DJ. A laparotomia és a laparoszkópia eltérően gyorsítja a kísérleti oldaltumornövekedést. Br J Surg 1998; 85: 1439-42.) (Da Costa ML, Redmond HP, Bouchier-Hayes DJ. A laparotomia és a laparoszkópia hatása a spontán tumormetasztázisok kialakulására. Sebészet 1998; 124, 516-26).

   A sebészi stresszt követő szuppresszív immunológiai változások időbeli mintázatot követnek. A tumorhoz kapcsolódó antigénnel szembeni celluláris immunitás és a késleltetett típusú túlérzékenység depressziója a műtét után legfeljebb 3 hétig fennáll. Hasnyálmirigyrákos betegeknél a szabályozó T-sejtek (Treg) prevalenciája megnövekszik a perifériás vérben, valamint a tumor mikrokörnyezetében. Ezek a Treg-sejtek (CD4+25+) a CD45R0 és a CTLA-4 molekulák, valamint citokinprofil együttes expressziója révén fenotípusosan hasonlóak a normál donorokból származó Treg-sejtekhez. A szabályozó CD4+25+ limfociták beszűrődnek a tumorba és a regionális nyirokcsomókba, és elnyomják a CD8+ limfociták és a segítő CD4+25-limfociták aktivációját (Liyanage, U. K., T. T. Moore, H. G. Joo, Y. Tanaka, V. Herrmann, G. Doherty, J. A. Drebin, S. M. Strasberg, T. J. Eberlein, P. S. Goedegebuure és D. C. Linehan. 2002. A szabályozó T-sejtek prevalenciája megnövekszik a perifériás vérben és a tumor mikrokörnyezetében hasnyálmirigy- vagy emlőadenokarcinómában szenvedő betegeknél. J. Immunol. 169:2756.

   Az NK, LAK, Treg és dendritikus sejtek aktivitásában és számában bekövetkezett változások onkológiai jelentőségét azonban még igazolni kell.

5. Célok / végpontok

   • A keringő rákos sejtek száma meghatározó a rák kiújulása és/vagy túlélése szempontjából a hasnyálmirigyrák potenciálisan gyógyító reszekcióját követően?
   • A keringő rákos sejtek genetikai profilja meghatározó a rák kiújulása és/vagy túlélése szempontjából a hasnyálmirigyrák potenciálisan gyógyító reszekcióját követően?
   • Korrelál-e a perioperatív immunszuppresszió a rák kiújulásával és/vagy a hasnyálmirigyrák potenciálisan gyógyító reszekcióját követő túléléssel?
6. Beteg kiválasztási és felvételi kritériumok: Potenciálisan gyógyítható/reszekálható hasnyálmirigyrák

7. Tanulmányi beavatkozások

   - A keringő rákos sejtek kvantitatív elemzése

   Jelen vizsgálatban perifériás vénás vérmintákat vesznek a műtét megkezdése előtt, a műtét végén, a műtét utáni első napon és a műtét utáni 7. napon centrális vénás katéteren keresztül. Tumorszövet-mintákat és véletlenszerű májszövet-biopsziákat vesznek intraoperatívan. Valós idejű kvantitatív RT-PCR technikát (TaqManR), amely 3 különböző célmarkeren (CEA, CK20 és EpCAM mRNS transzkriptumok) és béta-glükuronidázon (GUS) mint kontrollgénen alapul, a keringő rákos sejtek kimutatására és mennyiségi meghatározására szolgál. véráram. A normalizált példányszámot (NCN) minden mintában meghatározzák (két példányban elemezve). Az összes mintából az RNeasy mini kit (Qiagen, BD Company) segítségével RNS-kivonást végeznek. A keresztszennyeződés elkerülése érdekében a minta-előkészítést, a cDNS-szintézist és a PCR-t külön helyiségekben végezzük.

   - Disszeminált rákos sejtek genetikai profilalkotása

   Az elsődleges hasnyálmirigy-daganatból és a disszeminált rákos sejtekből kivont mRNS oligonukleotid microarray elemzése a műtét előtt, alatt és azt követő napon. Ennek a tanulmánynak nem az a célja, hogy specifikus markereket azonosítson a diagnózishoz vagy a gyógyszercélpontokhoz, hanem az áttétek jeleinek feltárása a véráramban keringő rákos sejtekben történő génexpresszió tanulmányozása révén. Fő célunk a keringő hasnyálmirigyráksejtek expressziós profiljának elemzése. A rák progressziója során gyakran megváltozott számos különböző útvonalat képviselő gének expressziójában bekövetkező változásokat elemzik, mint például a tumorszuppresszorok, onkogének, jelátviteli molekulák, növekedési faktorok és angiogenezis faktorok. A génexpressziós profiladatokat az apoptózisról, a sejtciklusról, a sejtnövekedésről és -differenciálódásról, a sejtmigrációról és -motilitásról, a jelátvitelről és más, rákkal kapcsolatos génekről szerezzük be. A microarray technológia legújabb fejlesztései magukban foglalják a teljes genom előállítását és olyan új amplifikációs stratégiák kidolgozását, amelyek lehetővé teszik az 1 ng össz RNS-nél kisebb minták elemzését (Xiang CC, Chen M, Kozhich OA, Phan QN, Inman JM, Chen Y , Brownstein MJ. Szonda generálása közvetlenül kis számú sejtből DNS microarray vizsgálatokhoz. Biotechnika 2003; 34: 386-8, 390, 392-3. Schindler H, Wiese A, Auer J, Burtscher H. cRNS target preparálása microarray-ekhez: különböző amplifikációs eljárásokkal előállított génexpressziós profilok összehasonlítása. Anal Biochem 2005; 344, 92-101. Puskás LG, Zvara Á, Hackler L Jr, Van Hummelen P. Az RNA amplification result in reproducible microarray data with slight ratio bias. Biotechniques 2002; 32, 1330-1341). Jelen tanulmány szerint a véráramban keringő rákos sejtek száma rendkívül alacsony lesz. Ezért lineáris RNS-amplifikációt (T7 RNS-polimeráz) alkalmaznak annak érdekében, hogy elegendő anyagot állítsanak elő a tömbök jelöléséhez és hibridizációjához. Rutinszerűen két amplifikációs kört hajtanak végre. Ezt már 700 Laser Capture Microdissectióval izolált sejtből sikeresen és reprodukálhatóan hajtották végre (az adatok nem publikáltak).

   - Sejtszuszpenziós microarray-k készítése keringő rákos sejtek izolálására.

   Bár a legtöbb microarray kihívás ismert és kontroll alatt van, a jelen tanulmánynak van egy fontos specifikus kihívása, a keringő rákos sejtek izolálása és dúsítása. Jelenleg nem ismert a keringő rákos sejtek aránya más sejtmagos vérsejtekhez (leukocitákhoz) viszonyítva a hasnyálmirigyrákban szenvedő betegeknél. Ezért az első lépés az lesz, hogy meghatározzuk a rákos sejtek számát egy ml vérben hasnyálmirigyrákos betegekben, és meghatározzuk a különböző betegek közötti variabilitást. A második lépés egy olyan dúsítási módszer kifejlesztése, amellyel a rákos sejtek koncentrálhatók anélkül, hogy a rákos sejtek meghatározott típusait választanák ki, vagy a rákos sejtek kezdeti arányával kapcsolatos információ elveszne az egyes betegek véráramában. A keringő rákos sejtek izolálásának leggyorsabb módja az áramlási citometria a sűrűséggradiens elődúsítást követően negatív szelekciós stratégiákkal kombinálva a leukociták (CD45+ és CD34+) eltávolítására a szétválogatott „keringő” rákos sejtekből. A sejtek LCM-mel történő izolálását sokszor sikeresen alkalmazták microarray vizsgálatokhoz. Beszámoltak arról, hogy az LCM könnyen eltávolíthat több ezer sejtet a hasnyálmirigyszövetből körülbelül 1 ng/1000 sejt RNS-hozamával (Datson NA, Meijer L, Steenbergen PJ. Morsiak MC, van der Laan S, Meijer OC, de Kloet ER. Az expressziós profil a lézerrel mikrodisszektált hippocampalis alrégiókban patkányagyban nagy szubrégió-specifikus expressziós különbségeket tár fel. Eur J Neurosci 2004; 20, 2541-2554. A játékos, Barrett JC, Kawasaki ES. Lézeres rögzítés mikrodisszekció, microarray és a rákos sejt pontos meghatározása. Expert Rev Mol Diagn 2004; 4, 831-40. Espina V, Geho D, Mehta AI, Petricoin EF 3., Liotta LA, Rosenblatt KP. A jövő patológiája: molekuláris profilalkotás a célzott terápiához. Cancer Invest 2005; 23:36-46. Crnogorac-Jurcevic T, Efthimiou E, Nielsen T, Loader J, Terris B, Stamp G, Baron A, Scarpa A és Lemoine NR. Mikrodisszekált hasnyálmirigy-adenokarcinómák expressziós profilja. Onkogén 2002; 21, 4587-4594).

   - Immunológiai változások

   Mivel a hasnyálmirigyrákban vagy a műtéten átesett betegekben hiányzik a tumortípus-specifikus immunreakció, a jelen tanulmány értékeli a szisztémás immunológiai változásokat, beleértve a citokinszinteket a hasnyálmirigyrákos betegek potenciálisan gyógyító műtétje előtt és után különböző időközönként.

   A PBMC-t a perifériás vénás vérből vonják ki, és a FACS (fluoreszcenciával aktivált sejtválogató) alatti további elemzéshez használják fel, hogy meghatározzák a következők előfordulását:

   • CD3-19+ (B-limfociták)
   • CD3+56+ (gyilkos sejtek)
   • CD3-56+CD16+ (NK természetes gyilkos sejtek)
   • CD8+ (citotoxikus T-limfociták)
   • CD4+25- (segítő T-limfociták)
   • CD4+25+127- (szabályozó T-limfociták)
   • A perifériás vérben lévő gyulladásos citokineket (IL-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 és TNF) a kereskedelemben kapható „BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammatory Kit” segítségével elemzik.
   • A PBMC-t (perifériás vér mononukleáris sejtjeit) és a tumorszövetet folyékony nitrogénben tárolják a jövőbeni vizsgálatok során.

8. Statisztikai analízis

   Egyváltozós analízis, valamint korrigált, többváltozós analízis kerül végrehajtásra a faktorok optimálisan kombinált prognosztikai csoportjának azonosítása érdekében: a beteg-, daganat- és kezeléshez kapcsolódó faktorok, valamint a disszeminált rákos sejtek mennyisége, genetikai expressziós profilja, ill. műtét utáni immunológiai változások. A vizsgálandó események a rák kiújulása (betegségmentes túlélés DFS) és a halál (teljes túlélési OS).

9. Várható beteggyarapodás "Single center study": UZ.Gasthuisberg - KU.Leuven, Belgium Várható éves betegregisztráció: 30 pont/év A beteggyűjtés időtartama: 2 év