Effetto di diverse strategie terapeutiche sulle cellule T regolatorie nel trapianto di rene (EVERTWIST)

La risposta immunitaria è mediata dall'interazione tra cellule presentanti l'antigene (APC), cellule T helper CD4+ (Th) e cellule T regolatorie (Treg), una sottopopolazione di cellule T CD4+ che esprime intensamente il recettore IL-2 (CD25) e la trascrizione FoxP3 fattore. Le cellule Treg contribuiscono a mantenere la tolleranza sopprimendo la risposta immunitaria agli autoantigeni normali o tumorali. Le cellule Treg hanno origine nel timo durante l'ontogenesi e rappresentano circa il 10% delle cellule periferiche CD4+. Tutti i linfociti T effettori si generano nel timo nelle prime fasi della vita e si evolvono attraverso la produzione di nuovi linfociti T, nonché attraverso l'espansione indotta dall'antigene di linfociti T periferici vergini (naive) che si convertono in linfociti T "memoria" e giacciono in organi linfoidi periferici (17). I linfociti T maturi costituiscono il 70-80% dei normali linfociti del sangue periferico, il 30-40% delle cellule linfonodali e il 20-30% delle cellule linfoidi spleniche.

I linfociti T sono effettori primari dell'immunità cellulo-mediata e si differenziano in una sottopopolazione di linfociti T citotossici CD8+ che sono in grado di lisare cellule estranee o cellule ospiti infettate da virus e una sottopopolazione di linfociti T CD4+ con attività di regolazione sui linfociti T e B e monociti, attraverso la produzione di citochine e il contatto cellula-cellula.

I linfociti Treg svolgono un ruolo centrale tra le cellule CD4+ nel bilanciare la tolleranza e l'immunità, in quanto sono responsabili del mantenimento della tolleranza periferica attraverso il controllo delle cellule T autoreattive sfuggite alla delezione timica (19). Gli studi hanno infatti dimostrato che se da un lato un difetto del loro sviluppo o della loro attività può portare a gravi malattie autoimmuni, un'eccessiva immunosoppressione mediata da queste cellule stimola, dall'altro, una condizione di immunodeficienza anche nei confronti degli antigeni prodotti dalle cellule neoplastiche favorendo, di conseguenza, la crescita del tumore.

I linfociti Treg rappresentano circa il 10% di tutte le cellule T CD4+ presenti nel timo, nel sangue periferico e nei tessuti linfoidi; sono costituiti da varie popolazioni che differiscono per la particolare espressione di molecole di superficie cellulare e per la produzione di diverse citochine, ma accomunate da una scarsa risposta alla stimolazione antigenica e da un'attività immunosoppressiva.

I linfociti Treg meglio caratterizzati sono i cosiddetti "Treg naturali" (nTregs), un sottogruppo di cellule T CD4+ che origina e si sviluppa nel timo durante il processo di maturazione delle cellule T e successivamente è normalmente presente nel sangue periferico con la funzione del controllo degli autoantigeni e della prevenzione delle malattie autoimmuni. Questi linfociti sono caratterizzati dall'espressione costitutiva di CD-25 (catena α del recettore dell'interleuchina-2), fattore di trascrizione Foxp3 (specifico di queste cellule e implicato nel controllo dello sviluppo all'interno del timo), superficie CTLA-4, GITR e LAG-3 molecole così come la citochina TGF-β, che è presente in grande quantità sulla superficie cellulare ed è fondamentale per il loro funzionamento.

Le cosiddette "Treg indotte" (iTreg) costituiscono l'altra categoria di linfociti Treg: si tratta di linfociti T CD4+ privi di potenziale regolatore intrinseco ma che acquisiscono la loro attività soppressiva grazie ad un'attivazione specifica e mediata da citochine (26). Sono prodotti in periferia e permettono lo sviluppo della tolleranza periferica agli antigeni self, non o scarsamente espressi nel timo. Gli iTreg sono costituiti da due diverse sottopopolazioni linfocitarie: Tr1, presente nella mucosa intestinale e caratterizzato da un'elevata produzione di IL-10 e TGF-β ma Foxp3 negativo; e T helper 3 (Th3), derivante dall'induzione di cellule T CD4+ native per ingestione di antigeni alimentari, responsabili della tolleranza orale. I Th3 sono Foxp3 positivi e rilasciano alti livelli di TGF-β (27).

Mentre gli iTreg sembrano funzionare solo mediante la produzione di citochine immunosoppressive come IL-10 e TGF-β, gli nTreg possono esercitare la loro attività anche attraverso vari meccanismi, come citochino-dipendenti, contatto cellulare-dipendenti o entrambi, a seconda della natura e intensità della risposta infiammatoria e del tessuto bersaglio a cui quest'ultima è diretta. Questo meccanismo di regolazione dipendente dal contesto porta all'elaborazione del modello di adattabilità e diversificazione all'interno della funzione di queste cellule: in altre parole, le Treg costituirebbe un sottogruppo cellulare funzionalmente omogeneo in cui ogni singola cellula può esercitare un meccanismo diverso a seconda delle caratteristiche di risposta infiammatoria. Alcuni autori ritengono invece che le Treg siano costituite da diverse sottopopolazioni, ognuna delle quali presenta propri meccanismi inibitori (27-28).

La caratterizzazione fenotipica delle Treg tra i linfociti umani circolanti è stata complicata dal fatto che il CD25 non è espresso esclusivamente dalle Treg ma anche dai linfociti non regolatori dopo l'attivazione, quindi attualmente solo le cellule CD4+ esprimono i più alti livelli di CD25 (CD4+CD25+bright) possono essere considerati autentici Treg.

Nel 2003 il Forkhead Transcription Factor (Foxp3) è stato identificato come il principale regolatore nello sviluppo di Tregs; la sua espressione è prevalentemente ristretta ai linfociti T CD4+CD25+ e l'espressione di Foxp3 nelle cellule T naive supporta la loro conversione in un fenotipo T regolatorio funzionalmente simile a nTregs. Foxp3 è quindi considerato un marcatore estremamente specifico delle cellule Treg ed è fondamentale per il controllo del loro sviluppo e funzionamento. In particolare, alcuni studi hanno dimostrato che la mancanza di Foxp3 alla nascita nell'uomo e nel ratto porta ad una massiccia iperproliferazione delle cellule T, con conseguente autoimmunità multiorgano e morte prematura (24), mentre la sua delezione nei ratti adulti provoca iperproliferazione ed espansione di cellule dendritiche e la morte entro due settimane. Sulla base di questi risultati Foxp3 sembra essere il marcatore ideale per lo studio della tolleranza.

La produzione di Tregs è strettamente controllata da segnali emanati da vari tipi di cellule, come cellule epiteliali, linfociti T e APC. Sebbene la presenza di quest'ultimo sia fondamentale per l'attivazione delle Treg mediata da TCR, la vera fase soppressiva in vitro indotta da nTregs è in realtà indipendente dall'APC. Implica infatti un meccanismo di contatto tra linfociti T effettori CD4+CD25- e nTreg CD4+CD25+.

Al momento disponiamo di scarse conoscenze sulle conseguenze funzionali della soppressione operata dalle Treg sui linfociti CD4+ e CD8+ ad esse sensibili, oltre a inibire la trascrizione di IL-2 e, di conseguenza, indurre l'interruzione del ciclo cellulare. Ulteriori meccanismi di soppressione immunitaria riportati da altri studi, ma non ancora confermati, sono i seguenti: induzione di anergia nelle cellule T reattive, reazione refrattaria agli effetti mitogeni di IL-2, rilascio di nuovi iTreg che possono sopprimere Th1 e Th2 producendo TGFβ1 e/o IL-10.

Gli NTreg richiedono particolari citochine per il loro sviluppo e la loro omeostasi. Inoltre, le Treg risultano essere ipoproliferative o anergiche all'attivazione del TCR, probabilmente a causa della loro incapacità di trascrivere e secernere attivamente IL-2. Questa citochina viene rilasciata principalmente dai linfociti T attivati ​​ma non dai nTreg ed esplica le sue attività biologiche legandosi al suo recettore, un complesso proteico di membrana formato da tre subunità: catena α (CD25), β e γ.

Quando IL-2 si lega al suo recettore nelle cellule T, attiva le Janus chinasi (JAK) che di conseguenza fosforilano e rilasciano le proteine ​​STAT5 (trasduttori di segnale e attivatori di trascrizione). IL-2 esercita infatti i suoi effetti sulle cellule T regolando diversi geni bersaglio principalmente a livello trascrizionale; non solo aumenta l'espressione delle catene α e β di IL-2R ma modula anche l'espressione di geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare, inducendo ad esempio l'up-regulation di proto-oncogeni come c-myc, c-fos e c-jun, nonché geni anti-apoptotici come bcl-2 o geni pro-apoptotici come il ligando Fas. IL-2 è essenziale per lo sviluppo e il mantenimento di nTreg, come alcuni studi hanno dimostrato: la deplezione indotta di IL-2 nei ratti provoca malattie autoimmuni che possono essere associate a un numero ridotto di linfociti Foxp3+ nTreg nel compartimento periferico.

Un'altra citochina importante per il funzionamento delle Treg è il TGF-β. Nonostante i suoi effetti inibitori su altre cellule T, è probabile che questo fattore di crescita supporti la produzione extra-timica di cellule Treg e l'aumento dell'espressione di Foxp3: questa azione è, tuttavia, necessaria esclusivamente all'induzione iniziale. Il TGF-β svolge quindi un ruolo diverso ma complementare rispetto all'IL-2.

Infine, un'altra citochina critica per il funzionamento dei linfociti Tr1 è l'IL-10. L'attivazione cronica in vitro dei linfociti CD4+ in presenza di IL-10 porta alla loro differenziazione in Tr1, alti livelli di IL-10 e TGF-β, bassi livelli di IL-2 e IL-4 e una scarsa proliferazione dopo restimolazione. IL-10 può inoltre indurre immunosoppressione favorendo la formazione di cellule T anergiche in grado di inibire l'attività di altri linfociti T attivati ​​attraverso un meccanismo contatto-dipendente, competendo con questi ultimi per specifici recettori APC (Antigen Presenting Cells) e per cellule prodotte localmente IL-2. Queste cellule T anergiche sono in grado di sopprimere la risposta immunitaria in vivo, poiché il loro trasferimento nei ratti sottoposti a trapianto di pelle allogenico ha mostrato una sopravvivenza più lunga al trapianto.

Oltre alle suddette citochine, altre sembrano essere coinvolte in modi diversi nella generazione e induzione delle Treg, come IL-4 e IL-13, mentre altre citochine hanno un effetto antagonista su di esse, come ad esempio IL-6, che contrasta la loro attività immunosoppressiva senza interferire con la proliferazione. Altri studi sulla funzione Treg hanno anche mostrato che una trasfusione di linfociti Treg allogenici e il successivo innesto cutaneo in ratti IL2Rβ-/- (rapidamente inclini a malattie autoimmuni letali se non trattate) non solo controllava e sopprimeva quelle malattie sebbene Treg e autoreattivi Le cellule T erano MHC-incompatibili, ma di conseguenza permettevano anche di stabilire uno stato di tolleranza a quei trapianti che presentavano molecole MHC comuni alle Treg donatrici. Questo esperimento ha poi dimostrato che le Treg sopprimono anche le cellule T autoreattive derivanti da donatori non correlati a MHC e quindi, teoricamente, che il pool di donatori per l'immunoterapia basata sulle Treg sarebbe potenzialmente molto ampio.

Grazie al loro ruolo essenziale nella tolleranza immunitaria e alla loro funzione immunosoppressiva, i linfociti Treg stanno quindi acquisendo sempre più importanza in trapiantologia, in quanto modelli sperimentali di trapianti d'organo hanno evidenziato la loro capacità di modulare l'attività delle cellule CD4+ e CD8+, entrambe responsabili del rigetto, inibendo it, e di sopprimere la GVHD (Graft-versus-host disease), mediando in questo modo la tolleranza allotrapianto. Ci sono, tuttavia, risultati controversi per quanto riguarda il fenotipo Treg e il loro meccanismo d'azione, a seconda del modello sperimentale e del protocollo utilizzato per indurre questa tolleranza.