Studio per esplorare gli effetti dei probiotici sui livelli di endotossine nei pazienti con diabete mellito di tipo 2

Progetto

In questo studio di 26 settimane, monocentrico, in doppio cieco, randomizzato, controllato con placebo, 60 pazienti con T2DM saranno trattati con probiotici e 60 saranno trattati con placebo. Gli interventi saranno effettuati alle settimane 0, 4, 8, 12 e 26 da tutti i soggetti. I pazienti assegnati al gruppo dei probiotici riceveranno capsule contenenti quattro ceppi di batteri liofilizzati, vale a dire Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum e Streptococcus thermophiles (Bio-plus®, Supherb, Israele), a una dose giornaliera di 2 × 1010 CFU. I partecipanti al gruppo placebo riceveranno capsule contenenti fibre non fermentabili a base di grano, utilizzate in un altro studio clinico [Pereg et al, 2011].

Reclutamento dei pazienti

Il reclutamento di pazienti per questo studio sarà reso possibile dalla collaborazione con i centri di cure primarie di Riyadh e il programma di ricerca sui biomarcatori, College of Science, King Saud University.

Criterio di inclusione

• T2DM stabile e ben controllato (HbA1c < 7,5% e nessun cambiamento nei farmaci antidiabetici orali negli ultimi 6 mesi)
• Età 20-75 anni
• Fornitura di consenso informato scritto

Criteri di esclusione

• Malattie gastrointestinali croniche (eccetto IBS)
• Antibiotici sistemici entro 6 settimane prima dell'inclusione
• Uso di probiotici entro 3 mesi prima dell'inclusione (l'Appendice A elenca i prodotti attualmente commercializzati a livello internazionale e disponibili per l'acquisto in Arabia Saudita)
• Assunzione regolare di insulina o analoghi dell'insulina, antibiotici o probiotici, antiacidi, bloccanti del recettore H2, inibitori della pompa protonica, loperamide, colestiramina, integratori di ω3, fibrati, corticosteroidi o steroidi sessuali
• Consumo giornaliero di alcol > 30 g
• Immunodeficienza significativa
• Malattia valvolare cardiaca nota
• Allattamento o gravidanza
• Etnia non araba
• Partecipazione a un altro studio clinico negli ultimi 6 mesi
• Incapacità legale

Assegnazione al trattamento

Dopo la conferma dell'idoneità e l'ottenimento del consenso informato scritto, ai pazienti verrà assegnato un numero di soggetto univoco dalla società di probiotici, che eseguirà anche la randomizzazione (stratificata per genere), i pazienti e i medici del centro di assistenza primaria saranno all'oscuro del trattamento ricevuto. I pazienti idonei saranno assegnati (1:1) al trattamento per 26 settimane con il supplemento di probiotici o il placebo. I soggetti saranno istruiti a

• Assumere 1 capsula prima di colazione e 1 capsula prima della cena, direttamente o mescolata allo yogurt standard.
• Le capsule andranno conservate in frigorifero dopo l'apertura del barattolo.

Gestione dei dati e conservazione dei registri

Il modulo di segnalazione del caso (CRF) verrà utilizzato per registrare i dati per tutti i partecipanti e sarà completato dall'infermiere ricercatore, che inserirà anche i dati in un database elettronico.

Orario e luogo di studio

Dopo l'inclusione, tutti gli ulteriori trattamenti saranno gestiti presso il centro di cure primarie in cui il soggetto è stato reclutato (vedere l'appendice C per le visite programmate). Un'infermiera ricercatrice e un dietista ricercatore saranno responsabili di tutti i contatti con i pazienti. I medici associati al gruppo di ricerca saranno disponibili in caso di problemi.

Acquisizione Dati Clinici e Valutazione di Compliance

• La storia medica, compresa la presenza di malattie croniche, farmaci regolari, fumo e abitudini alcoliche, verrà registrata prima dell'inclusione.
• Le abitudini nutrizionali saranno valutate utilizzando un questionario di richiamo standardizzato di 14 giorni, che sarà discusso con un dietologo
• Verranno registrati i cambiamenti nei farmaci durante il periodo di studio
• Le misurazioni antropometriche saranno effettuate utilizzando metodi standardizzati. L'altezza sarà misurata all'inizio del trattamento. Il peso (in abiti leggeri senza scarpe o oggetti in tasca), la circonferenza della vita (misurata come piano orizzontale a livello dell'ombelico) e la circonferenza dei fianchi (misurata come piano orizzontale a livello del grande trocantere) saranno misurati al inizio e fine del trattamento.
• L'ecografia epatica verrà eseguita allo screening o all'inizio del trattamento per determinare la presenza o l'assenza di un fegato luminoso indicativo di steatosi. Ai pazienti con fegato grasso e transaminasi epatiche > 1,5 × il limite superiore del normale verrà offerto il rinvio a un epatologo.
• La conformità sarà monitorata alle settimane 4, 8, 12 e 26. I pazienti porteranno le loro capsule precedentemente ricevute al centro di cure primarie per calcolare il numero medio di capsule ingerite al giorno.

Acquisizione di dati biochimici di routine e campioni biologici

• I campioni di sangue ottenuti saranno analizzati presso il programma di ricerca sui biomarcatori per misurare i livelli di glucosio, HbA1c, insulina, peptide C, colesterolo totale, colesterolo HDL, colesterolo LDL, trigliceridi, alanina aminotransferasi e aspartato aminotransferasi.
• I campioni di sangue a digiuno saranno raccolti alla settimana 0, 8 e 26. Il sangue venoso periferico verrà prelevato in provette apirogene senza alcun anticoagulante. Le provette saranno immediatamente poste in ghiaccio, lasciate coagulare e centrifugate (2500 ×g per 10 min a 4°C) entro 2 ore dal prelievo. I campioni di siero saranno conservati a -80°C fino al momento dell'uso. Verranno raccolti almeno due campioni di siero da 2 mL in ciascun punto temporale.
• Verranno prelevati campioni di feci chiedendo ai pazienti di conservare il campione in un sacchetto di plastica sigillabile nel congelatore fino al trasferimento in clinica. (prelievi negli stessi punti in cui sono richiesti per i prelievi di sangue. Una volta in clinica, i campioni saranno divisi, surgelati e conservati a -80°C. I cambiamenti nel microbiota intestinale saranno profilati utilizzando il sequenziamento con tag di firma (pyrosequencing) di geni 16S rRNA amplificati seguito da analisi bioinformatiche automatizzate. La RT-PCR mirata verrà utilizzata anche per esaminare specie batteriche come Enterobacteria e Bifdobacteria rispetto al set di primer batterici universali. Pyrosequencing e RT-PCR saranno eseguiti in una sottocoorte (n=15) di pazienti considerando i risultati sistemici finali. I campioni saranno conservati per studi successivi.

Soggetto Ritiro

I soggetti possono ritirarsi dalla sperimentazione in qualsiasi momento su loro richiesta, oppure possono essere ritirati in qualsiasi momento a discrezione dello sperimentatore per motivi di sicurezza, comportamentali o amministrativi. I soggetti saranno inoltre ritirati dallo studio in caso di:

• Trattamento con antibiotici sistemici per > 1 settimana durante la settimana 0-22
• Qualsiasi uso di antibiotici sistemici durante la settimana 22-26

La sicurezza del paziente

Eventi avversi

Gli eventi avversi (EA) sono segni o sintomi indesiderati che si verificano durante lo studio e possono o meno essere causalmente correlati al trattamento. Tutti gli eventi avversi considerati possibilmente, probabilmente o sicuramente correlati al prodotto in prova saranno registrati nelle CRF.

Eventi avversi gravi

Gli eventi avversi gravi (SAE) sono definiti come eventi fatali, pericolosi per la vita, invalidanti, invalidanti o che comportano il ricovero in ospedale o prolungano la degenza ospedaliera o provocano malformazioni. Tutti gli SAE saranno registrati nel CRF, indipendentemente dal fatto che siano correlati o meno al prodotto di prova. Secondo studi precedenti (9), i probiotici sono molto sicuri e qualsiasi SAE che potrebbe essere possibilmente, probabilmente o sicuramente correlato al prodotto in esame sarà considerato inaspettato. Tutti gli SAE imprevisti saranno segnalati immediatamente all'Agenzia di regolamentazione dei medicinali e dei prodotti sanitari (MHRA). Qualsiasi SAE che potrebbe essere correlato al test comporterà immediatamente l'interruzione del prodotto in prova.

Aspetti etici e normativi

Lo studio sarà condotto in conformità con il protocollo e i principi etici che hanno la loro origine nella Dichiarazione di Helsinki e con l'International Council for Harmonization Guidance on Good Clinical Practice. Questi documenti affermano che il consenso informato dei soggetti è un prerequisito essenziale per la partecipazione allo studio clinico. Lo studio inizierà solo dopo aver ottenuto l'approvazione dal comitato di revisione etica locale del Centro di ricerca del College of Medicine, King Saud University.

Piano per l'analisi dei dati

Poiché questo studio è progettato per valutare gli effetti fisiologici piuttosto che supportare indicazioni cliniche per il trattamento con probiotici nel T2DM, prevediamo di eseguire analisi per protocollo. Solo i soggetti trattati con almeno l'80% delle dosi pianificate per almeno l'80% del tempo saranno considerati trattati per protocollo.

I dati grezzi verranno inseriti in un software statistico (Statistical Package for the Social Sciences), SPSS versione 16.5 (Chicago, IL, USA). La preparazione del set di dati verrà effettuata prima delle analisi. Verranno effettuate statistiche descrittive; le frequenze saranno presentate in percentuale (%). Le variabili continue saranno presentate come media ± deviazione standard. Le variabili che presentano variabili non gaussiane saranno trasformate prima delle analisi. L'analisi a misure ripetute della covarianza (ANCOVA) sarà utilizzata per confrontare i gruppi, che rappresenteranno una combinazione di analisi della varianza (ANOVA) e regressione lineare. Verranno prese variabili confondenti e fisse come età e sesso, nonché BMI se non è stata raggiunta una corrispondenza corretta prima di misurazioni ripetute. Verranno apportate correzioni post-hoc Banjamini-Hohberg per confronti multipli. Per il confronto di 2 gruppi, verrà eseguito il test T indipendente per variabili continue e Mann-Whitney per variabili non continue. L'analisi degli eventi avversi (se presenti) verrà eseguita utilizzando il test Chi-quadrato e il test esatto di Fisher seguendo le ipotesi di casualità, indipendenza e dimensione. La significatività sarà fissata a p<0.05.