Funzione arteriosa e aterosclerosi nella trombocitemia essenziale

1. Pazienti e soggetti di controllo

   I pazienti sono selezionati dal database del Dipartimento di Ematologia presso il Centro medico universitario di Lubiana, in Slovenia, a cui è stato diagnosticato il ET positivo per JAK2 V617F tra il 2011 e il 2014. C'erano 124 pazienti ET JAK2 positivi, tra quelli 61 non avevano una storia personale di malattia vascolare aterosclerotica clinicamente manifesta (infarto del miocardio, angina pectoris, malattia arteriosa periferica, malattia aortica, attacco ischemico transitorio o ictus ischemico). 40 pazienti (14 maschi e 26 femmine) con ET positivo per JAK2 V617F senza malattia cardiovascolare clinicamente evidente hanno firmato il consenso informato e sono stati arruolati nello studio nel 2014-2015 per il primo esame e 36 (12 maschi e 24 femmine) sono attesi partecipare anche nel 2018-19.

   Il gruppo di controllo è selezionato tra i dipendenti sani del Centro medico universitario di Lubiana e i loro parenti. È abbinato al gruppo di pazienti per età e distribuzione del sesso e fattori di rischio classici per le malattie cardiovascolari. Al primo esame hanno partecipato 42 soggetti (16 maschi e 26 femmine) e al secondo esame si prevede la partecipazione di almeno 38 soggetti (14 maschi e 24 femmine).

2. Misure di base

   Ogni partecipante completerà un questionario sulla storia familiare di malattie cardiovascolari, storia medica personale, stato di fumo e farmaci. Verrà eseguito un esame fisico, comprese le misurazioni di altezza, peso, circonferenza della vita, pressione arteriosa sistolica e diastolica. Il sangue verrà prelevato per l'analisi di laboratorio del conteggio completo delle cellule del sangue, degli elettroliti, dei lipidi sierici, dei test di funzionalità epatica, dell'urea, della creatinina e dei marcatori infiammatori.

   Il rischio a 10 anni di malattia coronarica (CHD) e di malattia cardiovascolare generale (CVD) sarà calcolato utilizzando l'equazione del rischio di Framingham.

3. Carica allelica JAK2 V617F/G1849T

   Il kit ipsogen JAK2 MutaQuant, Qiagen (ZDA) (rif: n. 673523) verrà utilizzato per il rilevamento e la quantificazione dell'allele JAK2 V617F/G1849T nel DNA genomico estratto dal sangue periferico dei pazienti e anche dei soggetti di controllo. Un primer specifico SNP amplifica selettivamente l'allele JAK2 V617F che viene rilevato con uno strumento qPCR in tempo reale che quantifica i prodotti PCR. Il carico allelico JAK2 V617F sarà calcolato ed espresso come percentuale di alleli JAK2 V617F mutati nell'intero record JAK2. L'analisi verrà eseguita nel laboratorio del Dipartimento di Ematologia presso il Centro medico universitario di Lubiana per tutti i campioni.

4. Esame ecografico dell'arteria carotidea

   Per l'esame delle arterie carotidi extracraniche verrà utilizzato un ecografo Aloka Prosound α7 (Hitachi Aloka Medical, Ltd., Giappone) con una sonda vascolare lineare che lavora a una frequenza di 5-13 MHz. Saranno esaminate le arterie carotidee comune, interna ed esterna su entrambi i lati. Ad ogni esame, le misurazioni verranno effettuate due volte e verranno calcolati i loro valori medi. L'esame ecografico verrà eseguito dallo stesso ecografista in entrambe le visite di tutti i partecipanti.

   Lo spessore intima-media sarà misurato 2 cm prossimalmente al bulbo dell'arteria carotide comune su entrambi i lati. Verrà eseguito lo screening delle arterie carotidi extracraniche per placche aterosclerotiche, con definizione di placca di lesione focale, eccedente lo spessore intima-media per almeno il 50% o raggiungendo uno spessore assoluto di almeno 1,5 mm in due proiezioni ortogonali. Il punteggio delle placche aterosclerotiche viene eseguito secondo la metodologia del Rotterdam Study. La presenza di almeno una placca in ciascun segmento del letto arterioso carotideo extracranico, (suddiviso in arteria carotide comune e bulbo, arteria carotide interna e arteria carotide esterna) su entrambi i lati è valutato 1 punto. Pertanto, il punteggio della placca carotidea varia da 0 (assenza di placche) a 6 (placche presenti in tutti i segmenti su entrambi i lati).

   L'eco-tracciamento dell'arteria carotide comune sarà utilizzato per valutare la rigidità arteriosa espressa dall'indice di rigidità β e dalla velocità dell'onda del polso. Le misurazioni saranno effettuate all'arteria carotide comune 2 cm prossimalmente al bulbo su entrambi i lati. L'indice di rigidità β sarà calcolato come: β = ln (P_max / P_min) / [(D_max - D_min / D_min)], dove P_max = la pressione sistolica, P_min = la pressione diastolica; D_max = il diametro arterioso massimo e D_min = il diametro arterioso minimo. La velocità dell'onda di polso (PWV) sarà calcolata come: PWV = √ ((β x P_min) / 2ρ)); ρ = 1050 kg/m³.

5. Valutazione della funzione endoteliale delle arterie digitali

   La funzione endoteliale delle arterie digitali sarà misurata mediante pletimografia digitale con EndoPat 2000, Itamar Medical REF, Cesarea, Israele, versione software 3.3.x ed espresso come indice di iperemia reattiva (RHI) e indice di aumento (AI). I cambiamenti nel tono arterioso vengono suscitati creando una risposta iperemica a valle indotta da un'occlusione standard di 5 minuti dell'arteria brachiale (utilizzando un bracciale per la pressione sanguigna, gonfiato a 60 mmHg sopra la pressione arteriosa). Quando la cuffia viene rilasciata, l'aumento del flusso sanguigno provoca una dilatazione mediata dal flusso endotelio-dipendente (FMD) che si manifesta come iperemia reattiva. Un rapporto tra post-occlusione e pre-occlusione viene calcolato dal software EndoPAT e vengono determinati e A). I risultati sono normalizzati a una frequenza cardiaca di 75/min.

6. Misurazione del carico di calcio dell'arteria coronaria

   Il carico di calcio delle arterie coronarie viene misurato con uno scanner PET-CT Biograph M a 128 righe (Siemens, Erlangen, Germania). La scansione viene eseguita dalla base all'apice del cuore. Viene utilizzato un protocollo senza mezzo di contrasto con attivazione sequenziale dell'ECG prospettico. Il tempo di rotazione è di 0,33 sec, con una tensione del tubo di 120 kV, CARE Dose 4D e spessore della fetta 3 mm, senza sovrapposizione delle fette. La post-elaborazione viene eseguita sulla workstation Syngo Leonardo. Il carico coronarico di calcio è espresso come punteggio di Agatston. La valutazione del set di dati di ogni soggetto dello studio viene eseguita tre volte e il valore medio viene utilizzato per ulteriori analisi.

7. analisi statistica

Tutti gli insiemi di dati saranno testati per la normalità della distribuzione utilizzando il grafico normale-quintile, calcolando il coefficiente di correlazione e controllandolo per il valore critico che giustificherebbe il rifiuto della distribuzione normale con una probabilità di errore α di 0,05.

I dati con distribuzione normale saranno presentati come media e deviazione standard, mentre i dati con distribuzione non normale saranno presentati come mediana e range tra il 1° e il 3° quartile.

Le differenze tra soggetti con TE e soggetti di controllo al primo e al secondo esame saranno verificate mediante il test del chi-quadrato per variabili discrete, per variabili continue normalmente distribuite mediante il t-test di Student appaiato per campioni indipendenti e per variabili continue non normalmente distribuite variabili dal test di Mann-Whitney per campioni indipendenti. I valori P <0,05 saranno considerati significativi con una correzione per confronti multipli.

I cambiamenti nella funzione vascolare e nella morfologia nel periodo di osservazione di 4 anni saranno confrontati tra i due gruppi mediante il log rank test. I valori P <0,05 saranno considerati significativi.

L'associazione tra i parametri di funzione/morfologia vascolare e il carico allelico JAK2 V617F sarà valutata mediante il coefficiente di correlazione di Pearson.