Risolvere diagnosi complesse attraverso sequenze di lettura ultra lunghe (SCHeDULeRS)

Le prestazioni diagnostiche di LRS, applicando la Oxford Nanopore Technology (ONT), saranno valutate attraverso un approccio mirato in tempo reale e la generazione di letture ultra lunghe, per l'identificazione di varianti patogenetiche in malattie genetiche con una diagnosi attualmente difficile a causa della presenza di pseudogeni (1) e alla precisa mappatura dei breakpoint SV identificati da aCGH per la definizione del loro significato clinico (2).

1. Verranno raccolti pazienti con diagnosi molecolare accertata per ciascuno dei seguenti disturbi: 10 con malattia renale policistica autosomica dominante (ADPKD) e 10 con deficit di CYP21. Verranno inclusi casi con risultati ambigui per testare possibili miglioramenti dell'ONT in termini di tempo per ottenere risultati e precisa caratterizzazione molecolare. Verrà inclusa l'intera gamma di mutazioni che colpiscono ciascun gene causale (PKD1 e CYP21A2, rispettivamente), che coprono globalmente tutti i possibili tipi di alterazioni (missense, nonsense, Indels, esoniche e delezioni geniche).
2. Raccolta di altri 10 pazienti portatori di varianti del numero di copie (CNV) con punti di interruzione definiti da aCGH che mappano vicino ai geni della malattia possibilmente responsabili del quadro clinico osservato.

Lo scopo principale di questa proposta è valutare l'efficacia dell'ONT nel risolvere le sfide diagnostiche affrontate nella routine di genomica clinica, in situazioni in cui una diagnosi molecolare precisa è spesso impossibile o difficile ed estremamente dispendiosa in termini di tempo con gli attuali test genetici. Il sequenziamento di Sanger, i pannelli NGS e l'MLPA vengono abitualmente utilizzati per identificare varianti patogene e CNV responsabili di molti disturbi monogenici e per l'analisi attraverso aCGH di pazienti con disabilità intellettiva isolata o sindromica senza uno specifico sospetto clinico. Queste analisi sono lunghe, tecnicamente laboriose e spesso non individualmente conclusive perché i limiti tecnici possono portare a risultati ambigui e impedire una diagnosi definitiva. L'intento è dimostrare che ONT, attraverso un approccio mirato in tempo reale per aumentare la copertura nelle regioni clinicamente rilevanti durante il sequenziamento, supera gli attuali strumenti diagnostici in termini di rapidità e sensibilità, migliorando notevolmente l'efficienza del processo diagnostico. Il successo dell’approccio target ONT proposto fornirà la prova di principio per implementare questa strategia per la diagnosi di uno spettro più ampio di disturbi già studiati nel nostro laboratorio