塩感受性および免疫細胞の活性化

研究者は、以前に報告されたように、20 人の患者にワインバーガー プロトコルを採用します。 彼らは参加者に、プロトコルの開始まで通常の食事と塩の消費を維持するようにアドバイスし、入院前日に24時間尿検体を採取するための容器と適切な指示を提供します. 入院は2週間後に行われ、薬の効果を洗い流し、夕方には、患者がプロトコルを開始する前に病院で一晩休む. この 2 週間の間、未治療の血圧は、自宅または暫定的に予定された訪問のいずれかで患者によって監視され、180/110 mmHg を超えていないことを確認します。その場合、プロトコルは安全のために中止されます。 入院時に、ベースラインの尿量が測定され、アリコートが研究室に送られるか、研究検体用に-80℃で凍結されます。 入院後の朝 (午前 6 時) に、外来血圧モニター (SpaceLabs 90207 または 90210) を設定して、研究全体を通して継続的に血圧を記録します (午前 6 時から午後 10 時までは 15 分ごと、午後 10 時から午後 10 時までは 30 分ごと)。午前6時）、患者がガウンを着用して体重が記録され（将来の日と同じスケール）、以下に説明する研究の分析物のために血液サンプルが取得され（ベースラインテスト）、新しい24時間の収集が行われます午前8時に塩負荷の期間を開始しました。 塩分負荷は、高塩食（等カロリー、160mEq Na と 70mEq K を含む）を組み合わせることで達成されます。これは、患者が完全に消費するものであり、2L の生理食塩水（300mEq Na+）の注入です。 患者は自由に水を飲むことができますが、食事はプロトコルによって提供されるものに制限されます。 彼らは午後10時に就寝します。 翌朝 (午前 6 時) に体重と血液サンプルを再度採取し、午前 8 時に意図的に排尿して 24 時間の収集を完了します。 これらの実験データは、塩負荷の影響を反映します。 午前 8 時に、被験者は減塩にさらされます。 これは、10 mEq Na と 70 mEq K を含む等カロリー食と、継続的な無制限の水分摂取によって達成されます。 午前 8 時、正午、午後 4 時に、対象に 40 mg のフロセミドを経口投与します。 さらに 12 時間の採尿を午前 8 時に開始し、午後 8 時に意図的に排尿して終了します (フロセミド ナトリウム利尿の期間を反映)。 新しい 12 時間の収集は午後 8 時に開始され、翌朝の午前 8 時に意図的に排尿して終了します (減塩期間を反映)。 翌朝 (午前 6 時) に体重の最後の記録と血液サンプルの採取が行われ、午前 8 時までに減塩期間の 12 時間の尿収集が完了します。 患者には通常の病院食から朝食が与えられ、減塩介入によってめまいが生じたり起立性が記録されている場合は、塩辛い食べ物や水分が補充される場合があります。 患者が安定し、直立姿勢への耐性を示したら、起立性の存在によりレジメンの変更が必要でない限り、降圧薬を再開するように指示されて退院します。チーム。

実験室の血液測定: 血液サンプルの 3 つの毎日のセットで実施されるテストには、次のものが含まれます。 VUMC の中央検査室での CBC およびルーチンの化学検査 (血清クレアチニン、Na+ および K+ を含む)。ラジオイムノアッセイによる血漿レニン活性;ラジオイムノアッセイによる血漿アルドステロン;液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析による VUMC のエイコサノイド コアにおける血漿エイコサトリエン酸 (EETs) および 20-ヒドロキシエイコサテトラエン酸 (20-HETE)。

尿検査: 4 つの尿検体 (24 時間のベースライン、24 時間の塩負荷、12 時間のフロセミド ナトリウム利尿、および 12 時間の塩分除去) で実施されるテストには以下が含まれます。 VUMCの中央検査室におけるNa+、K+およびクレアチニン濃度。液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析による VUMC のエイコサノイド コアでの尿中エイコサトリエン酸 (EET) および 20-ヒドロキシエイコサテトラエン酸 (20-HETE)。

血圧の塩感受性の定義: モニターからの血圧データがダウンロードされ、正午 (生理食塩水注入の終了) から午後 10 時までの塩負荷の日の収縮期血圧の平均が使用されます。研究の塩負荷期間のBP。 正午１２時（フロセミドの２回目の投与）から午後１０時までの減塩日の収縮期血圧の平均を、減塩試験期間のＢＰとして使用する。 塩分負荷から塩分枯渇期間までの収縮期血圧が10mmHg以上低下することを使用して、被験者を塩分感受性として分類します。

ナトリウム MRI イメージング: 研究者は、ヴァンダービルト イメージング研究所で、ヒトの組織に蓄積された Na+ を非侵襲的に検出します。 彼らは、以前に報告されたアプローチに厳密に準拠して、23Na MRI によって皮膚の Na+ 含有量を定量化します.6, 37、38。 イメージングは​​、Philips Achieva 3.0T MR スキャナー (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) と 23Na 直交膝コイル (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Germany) で行われます。 調査官は、参照基準としてキャリブレーション ファントム (NaCl 濃度が増加する水溶液) を使用し、品質管理のために対象者のふくらはぎの筋肉のセクションと共にそれらをスキャンします。 左下腿 (ふくらはぎ領域の最も広い部分) は、皮膚がファントム ホルダーの硬い表面に密着した状態で 3 分 52 秒間スキャンされます。 すべての画像データは、カスタム MATLAB (R2013a) スクリプトを使用してオフラインで処理されます。 Na+ の定量化は、Na+ 画像上の組織ファントムとキャリブレーション ファントムの間の信号強度を比較することによって実行されます。 ファントム データに基づいて線形関係 (Na+ 濃度と信号強度) が評価され、線形回帰の結果が組織領域に適用されて Na+ 含有量が定量化されます。

免疫細胞活性化研究: 研究者は、塩感受性がヒト単球の活性化状態に関連しているかどうかを判断します。 ヘパリン処理された血液サンプル (40 ml) が得られ、PBMC が Ficoll 勾配によって分離されます。 単球は、Miltenyi 単球分離キットを使用した磁気標識およびネガティブ選択によって PBMC から分離され、フローサイトメトリーを使用して分析されます。 彼らは単球を CD45+/CD14+ 細胞として識別し、さらに中間 (CD14+/CD16+ および非古典的単球 (CD14-/CD16+)) を調べることができます。 循環の約 10% を構成する CD14+/CD16+ 細胞は特に興味深いものであり、それらは TNFalpha のレベルを増加させ、T 細胞の活性化を促進します。 これらは、高血圧のヒトで増加し、in vitro での Na+ 曝露の上昇に反応して増加します。 DCのサブタイプの数は比較的まれですが、研究者はCD45+/CD1c+、CD45+/CD141+、CD45+/CD209+、CD45+/CD83+、および最近同定されたAxl/SICLEC6細胞を測定することにより、それらを定量化します。 7-AAD は、死細胞を除外するために使用されます。 IsoLGタンパク質付加物を検出するために、単鎖抗体D-11を用いた細胞内染色が使用されます。 成熟した抗原提示細胞に発現し、T 細胞共刺激に参加できるようにする CD80 および CD86 の表面発現を測定します。 総白血球 (CD45+ 細胞)、B 細胞 (CD45+/CD19+)、総 T 細胞 (CD45+/CD3+ 細胞)、および T 細胞サブタイプ (CD3+/CD8+ およびCD4+) 細胞も実行されます。 これらの実験は、図 2 に示すように、塩感受性が単球に反映されているかどうかを判断するために、新たに単離した細胞、および通常の塩または高塩に 48 時間さらした単球でも実施します。48 時間培養した単球の培地は、ルミネックスを使用して、IL-1 ベータ、TNF-アルファ、IL-6、および IL-23 を含むサイトカイン放出を分析しました。 研究者は、単球から DC への変換を担う GM-CSF、IL-4、Flt3 リガンドなどのサイトカインを評価するための血漿も入手します。 再現性を確保するために、サンプルは Vanderbilt Endocrinology and Metabolism Core Facility に提出され、盲検化された Luminex 分析が行われます。 O2·- の測定と NADPH オキシダーゼの活性化 (p47phox のリン酸化および p47phox と gp91phox の結合を含む) の測定は、ベースライン時および Na+ の上昇に応答して、前述のように行われます。