Citlivost na sůl a aktivace imunitních buněk

Vyšetřovatelé použijí Weinbergerův protokol u 20 pacientů, jak bylo uvedeno dříve. Poradí účastníkům, aby do začátku protokolu dodržovali obvyklou dietu a konzumaci soli, a poskytnou jim nádobku a příslušné instrukce k odběru 24hodinového vzorku moči den před přijetím do nemocnice. Přijetí se uskuteční o dva týdny později, aby se vymýtil účinek léků, a večer, aby pacient odpočíval přes noc v nemocnici před nástupem na protokol. Během těchto dvou týdnů bude neléčený krevní tlak monitorován pacienty buď doma, nebo v rámci pravidelných návštěv, aby se zajistilo, že nepřekročí 180/110 mmHg, v takovém případě bude protokol pro jistotu přerušen. Při přijetí se změří objem základní moči a alikvoty se pošlou do laboratoře nebo zmrazí na -80 °C pro výzkumné analyty. Ráno po přijetí (6:00) bude zřízen ambulantní měřič krevního tlaku (SpaceLabs 90207 nebo 90210) pro nepřetržitý záznam krevního tlaku po celou dobu studie (každých 15 minut od 6:00 do 22:00 a každých 30 minut od 22:00 do 6:00), bude zaznamenána tělesná hmotnost pacienta v plášti (stejné měřítko jako v příštích dnech), budou odebrány vzorky krve pro analyty studie popsané níže (základní testy) a bude proveden nový 24hodinový odběr zahájena po dobu nakládky soli v 8 hodin. Naplnění solí bude dosaženo kombinací diety s vysokým obsahem soli (izokalorické, se 160 mEq Na a 70 mEq K), kterou pacient spotřebuje celou, a infuzí 2 l fyziologického roztoku (300 mEq Na+). Pacienti budou mít volný přístup k vodě, ale jejich jídlo bude omezeno na to, co poskytuje protokol. Spát půjdou ve 22 hodin. Následující ráno (6:00) budou opět odebrány vzorky tělesné hmotnosti a krve a 24hodinový odběr bude ukončen záměrným vyprázdněním v 8:00. Tyto laboratorní údaje budou odrážet vliv zatížení solí. V 8 hodin ráno budou subjekty vystaveny vyčerpání solí. Toho je dosaženo podáváním izokalorické stravy obsahující 10 mEq Na a 70 mEq K a pokračujícím neomezeným příjmem vody. V 8:00, 12:00 a 16:00 bude subjektům podáváno 40 mg furosemidu perorálně. Další 12hodinový sběr moči bude zahájen v 8 hodin ráno a ukončen záměrným vyprázdněním ve 20 hodin (odráží období furosemidové natriurézy). Nová 12hodinová sbírka začne ve 20:00 a bude uzavřena úmyslným vyprazdňováním následující ráno v 8:00 (odráží období vyčerpání soli). Druhý den ráno (6:00) proběhne poslední záznam tělesné hmotnosti a odběr vzorků krve a do 8:00 bude ukončen 12hodinový sběr moči na období vyčerpání solí. Pacientům bude podávána snídaně z běžné nemocniční stravy, která může být doplněna slaným jídlem nebo tekutinami, pokud intervence na odstranění soli způsobila závratě nebo dokumentovanou ortostázu. Jakmile je pacient stabilizovaný a projevuje toleranci ke vzpřímenému držení těla, bude propuštěn domů s pokyny k obnovení antihypertenzní medikace, pokud přítomnost ortostázy nevyžaduje úpravu režimu, kterou doporučí lékař, který je členem výzkumu. tým.

Laboratorní měření krve: Testy prováděné ve 3 denních sadách krevních vzorků budou zahrnovat; CBC a rutinní chemie (včetně sérového kreatininu, Na+ a K+) v centrální laboratoři VUMC; Plazmatická aktivita reninu radioimunoanalýzou; Plazmatický aldosteron radioimunotestem; Plazmové eikosatrienové kyseliny (EET) a 20-hydroxyeikosatrienová kyselina (20-HETE) na eikosanoidovém jádru VUMC pomocí kapalinové chromatografie/tandemové hmotnostní spektrometrie.

Analýza moči: Testy, které mají být provedeny ve 4 vzorcích moči (24hodinová výchozí hodnota, 24hodinová zátěž solí, 12hodinová furosemidová natriuréza a 12hodinová deplece solí) budou zahrnovat; koncentrace Na+, K+ a kreatininu v centrální laboratoři VUMC; Eikosatrienové kyseliny v moči (EET) a 20-hydroxyeikosatrienová kyselina (20-HETE) v eikosanoidovém jádru VUMC kapalinovou chromatografií/tandemovou hmotnostní spektrometrií.

Definice citlivosti krevního tlaku na sůl: Budou stažena data krevního tlaku z monitorů a jako průměr bude použit průměr systolického krevního tlaku v den naplnění solí od 12 hodin (konec infuze fyziologického roztoku) do 22 hodin. BP pro období studie nakládání solí. Průměr systolického krevního tlaku v den deplece soli od 12:00 (druhá dávka furosemidu) do 22:00 bude použit jako TK pro období studie s deplecí solí. Pokles systolického TK ≥10 mm Hg od období nasycení solí do období vyčerpání solí bude použit ke klasifikaci subjektu jako citlivého na sůl.

Sodíkové zobrazování magnetickou rezonancí: Výzkumníci budou neinvazivně detekovat ukládání Na+ v lidských tkáních ve Vanderbilt zobrazovacím institutu. Budou kvantifikovat obsah Na+ v kůži pomocí 23Na MRI s přísným dodržováním dříve uváděných přístupů.6, 37, 38. Zobrazování se provádí na MR skeneru Philips Achieva 3.0T (Philips Healthcare, Cleveland OH, USA) s 23Na kvadraturní kolenní cívkou (Rapid Biomedical GmbH, Rimpar, Německo). Výzkumníci používají kalibrační fantomy (vodné roztoky se zvyšující se koncentrací NaCl) jako referenční standardy a skenují je spolu s řezy přes lýtkové svaly subjektu pro kontrolu kvality. Levá bérce (nejširší část oblasti lýtka) se skenuje s kůží v těsném kontaktu s tvrdým povrchem držáku fantomu po dobu 3 minut a 52 sekund. Všechna obrazová data jsou zpracovávána off-line pomocí vlastních skriptů MATLAB (R2013a). Kvantifikace Na+ se provádí porovnáním intenzit signálu mezi tkání a kalibračními fantomy na snímku Na+. Lineární vztah (koncentrace Na+ vs intenzita signálu) je hodnocen na základě fantomových dat a výsledky lineární regrese jsou aplikovány na tkáňové oblasti pro kvantifikaci obsahu Na+.

Studie aktivace imunitních buněk: Výzkumníci určí, zda je citlivost na sůl spojena se stavem aktivace lidských monocytů. Získají se vzorky heparinizované krve (40 ml) a PBMC se izolují Ficoll-gradientem. Monocyty se izolují z PBMC magnetickým značením a negativní selekcí za použití soupravy pro izolaci monocytů Miltenyi a analyzují se pomocí průtokové cytometrie. Identifikují monocyty jako buňky CD45+/CD14+ a mohou dále zkoumat intermediární (CD14+/CD16+ a neklasické monocyty (CD14-/CD16+). CD14+/CD16+ buňky, které tvoří asi 10 % cirkulace, jsou zvláště zajímavé, protože produkují zvýšené hladiny TNFalfa a podporují aktivaci T buněk. Ty jsou zvýšené u lidí s hypertenzí a v reakci na in vitro zvýšenou expozici Na+. Ačkoli počet podtypů DC je relativně vzácný, výzkumníci je budou kvantifikovat měřením buněk CD45+/CD1c+, CD45+/CD141+, CD45+/CD209+, CD45+/CD83+ a nedávno identifikovaných buněk Axl/SICLEC6. 7-AAD se používá k vyloučení mrtvých buněk. K detekci aduktů IsoLG-proteinu bude použito intracelulární barvení jednořetězcovou protilátkou D-11. Bude měřena povrchová exprese CD80 a CD86, které jsou exprimovány na zralých buňkách prezentujících antigen, což jim umožňuje účastnit se kostimulace T buněk. Obecná charakterizace mononukleárních buněk periferní krve průtokovou cytometrií pro další zánětlivé buňky včetně celkových leukocytů (CD45+ buňky), B buněk (CD45+/CD19+), celkových T buněk (CD45+/CD3+ buňky) a podtypu T buněk (CD3+/CD8+ a CD4+) buňky budou také provedeny. Tyto experimenty budou provedeny na čerstvě izolovaných buňkách a také na monocytech vystavených normální soli nebo vysokému obsahu soli po dobu 48 hodin, aby se určilo, zda se citlivost na sůl odráží v monocytech, jak je znázorněno na obr. 2. Médium z monocytů kultivovaných po dobu 48 hodin je analyzovány na uvolňování cytokinů včetně IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6 a IL-23 pomocí luminexu. Výzkumníci také získají plazmu pro hodnocení cytokinů včetně GM-CSF, IL-4 a Flt3 ligandu, které jsou zodpovědné za konverzi monocytů na DC. Aby byla zajištěna reprodukovatelnost, vzorky budou odeslány do Vanderbilt Endokrinology and Metabolism Core Facility k provedení zaslepené analýzy Luminex. Měření produkce O2·- a aktivace NADPH oxidázy včetně fosforylace p47phox a asociace p47phox s gp91phox pomocí imunoprecipitace a western blotu jak na základní linii, tak v reakci na zvýšené Na+ budou provedena dříve.