중환자실(ICU) 내 인공호흡기 관련 폐렴(VAP)

소개

인공호흡기 관련 폐렴(VAP)은 일반적으로 기관내 삽관 및 기계적 환기로부터 48시간 후에 발생하는 병원내 폐렴을 의미합니다. 기계적 환기를 받는 ICU 환자는 폐렴 발병 위험이 4배 더 높으며, 집중 치료실. 기계 환기 기간, 만성 폐 질환, 패혈증, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 신경계 질환 및 외상을 포함하여 VAP와 관련된 몇 가지 위험 요소가 보고되었습니다. 면역 체계는 감염으로부터 숙주를 방어합니다. 방어면역은 선천면역과 적응면역으로 나눌 수 있다. 선천적 면역 반응은 숙주의 첫 번째 방어 장벽으로 진화하고 즉각적이지만 비특이적인 면역 반응을 일으켜 침입자를 빠르게 파괴하거나 제한합니다. 선천적 방어 메커니즘은 외부 상피, 점막 표면, 세포(NK 세포, 식세포) 및 보체 시스템입니다.

적응 면역은 T(세포) 및 B(체액) 세포 매개 반응을 포함하는 2차 방어입니다. 이것은 특이적이고, 자신이 아닌 병원체만을 대상으로 하며, 재감염에 대해 오래 지속되는 면역을 유지하는 기억을 가지고 있습니다. 선천면역계는 적응면역의 미세한 특이성이 부족하지만 자기와 비자기를 구분할 수 있다. 선천적 면역 인식은 미생물 병원체와 관련된 보존된 분자 패턴(병원체 관련 분자 패턴, PAMP)을 인식하는 패턴 인식 수용체(PRR)라는 생식계열 암호화 수용체 시스템에 의해 매개됩니다. 이러한 수용체는 다양한 유도성 면역 반응 유전자의 발현을 조절하는 신호 전달 경로에 결합됩니다.

TLR은 선천적 면역 반응과 적응 면역 반응을 모두 제어합니다. TLR 유도 염증 반응은 어댑터 분자 MyD88에 의해 매개되는 일반적인 신호 경로에 의존합니다. TLR 발현은 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 장, 폐 및 진피에서 유래한 상피 세포, B- 및 T-림프구와 같은 다양한 세포에서 관찰됩니다. TLR4는 확인된 최초의 포유류 TLR이며 리포다당류의 인식에 관여합니다 (LPS), 패혈증을 유발할 수 있는 그람 음성 박테리아의 주요 세포벽 성분. TLR2는 가장 강력한 수용체이며 박테리아, 효모, 곰팡이, 기생충 및 바이러스의 다양한 PAMP를 인식합니다. TLR9는 박테리아 DNA에 존재하는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 인식합니다.

패혈증 증후군은 종종 병원내 감염, 특히 그람 음성 폐렴의 발생에 의해 복잡해집니다. 결과는 TLR9가 폐의 세균성 병원균에 대한 보호 선천적 반응 생성에 중요한 신호 역할을 하며 그람 음성 세균성 병원균에 대한 효과적인 선천적 면역 반응에 필요함을 나타냅니다. 메틸화되지 않은 CpG 모티프는 박테리아에서 널리 퍼져 있지만 척추동물 게놈 DNA에서는 그렇지 않습니다. CpG 모티프의 인식은 선천적 및 후천적 면역 반응으로 이어지는 숙주 방어 메커니즘을 활성화합니다. TLR-9를 발현하는 세포는 형질세포양 수지상 세포(PDC)와 B 세포이며 결과적으로 Th1 유사 전염증성 사이토카인, 인터페론 및 케모카인을 생성합니다. TLR-9의 활성화는 a) Th1 전염증성 사이토카인인 사이토카인(IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), 인터페론(IFN)-γ 및 종양 괴사 인자(TNF-)α의 생성을 유도합니다. 및 b) 면역억제를 유도하는 Th2 전염증성 사이토카인인 IL-10 및 IL-4.

Th1 사이토카인은 대식세포, NK 세포 및 호중구의 염증 및 활성화에 중심적인 역할을 합니다. Th2 사이토카인은 Th1 면역 반응을 억제합니다. 이것은 전신 전신 염증 반응 증후군을 유발합니다. 또한, 톨-유사 수용체-2(TLR2) 및 -4(TLR4)는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에서 중요한 역할을 합니다. 그람(-) 및 그람(+) 박테리아의 LPS에 의한 이들의 활성화는 호중구, NK 세포, T-, B- 세포 및 염증성 사이토카인의 활성화를 유도합니다. 만성 질환에서 조절되지 않는 염증은 이러한 시스템을 지속적인 활성화 상태로 유지하여 잠재적으로 조직 손상 및 진행성 질환을 유발합니다. TLR 시스템을 이해하면 숙주 면역 반응을 조작할 수 있는 귀중한 기회를 제공해야 합니다.

목표

1. VAP의 병인에서 CD4+ και CD8+ T 림프구의 역할을 조사하고 설명합니다. 또한, 사이토카인 IL-4 및 IFN-γ의 수준은 ICU에 있는 환자가 VAP를 발생시키는 시간 및 T 림프구의 하위 집단에 대한 변화를 나타낸다.
2. VAP 환자에서 대식세포의 아폽토시스 및 식세포 능력을 평가합니다.
3. TLR-2, TLR-4 및 TLR-9 유전자의 발현 및 가능한 다형성을 연구합니다.

VAP에 대한 면역 반응을 이해하면 면역 반응을 조절하기 위한 면역 요법 프로토콜을 준비할 수 있습니다.

행동 양식

재료 및 방법

기관지 폐포 세척 처리

첫날에 각 환자의 혈액 샘플에서 기관지 폐포 세척(BAL) 및 기관지 흡인(TBA)을 실시합니다. 기관지경 검사는 진단 및 치료 목적으로 기도 내부를 시각화하는 기술입니다. 기관지경은 일반적으로 코나 입을 통해 또는 경우에 따라 기관절개술을 통해 기도로 삽입됩니다. 이를 통해 개업의는 이물질, 출혈, 종양 또는 염증과 같은 이상이 있는지 환자의 기도를 검사할 수 있습니다. 표본은 폐 내부에서 채취할 수 있습니다: 생검, 체액(기관지폐포 세척) 또는 기관지 칫솔질. BAL은 일반적으로 폐 질환을 진단하기 위해 수행됩니다. 특히, BAL은 일반적으로 면역 체계 문제가 있는 사람의 감염, 인공 호흡기를 사용하는 사람의 폐렴 및 일부 유형의 폐암을 진단하는 데 사용됩니다. BAL은 면역학적 연구에서 폐(T 세포 집단)의 세포 또는 병원체 수준을 샘플링하는 수단으로 자주 사용됩니다. 검체는 VAP 진단 후 48시간 이내에 다시 채취할 수 있습니다. BAL을 10% FBS-RPMIc 및 원심분리기에 400g, 5분 동안 넣은 다음 RPMI-1640 및 10% FBS를 추가합니다. 세포의 수와 유형은 Μay-Grunwald-Giemsa 염색 및 유세포 분석을 사용한 하위 집단에 의해 정의됩니다.

PBMC 격리

인간 림프구는 탄수화물 중합체 Ficoll(Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1)을 사용한 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 가장 쉽게 분리될 수 있습니다. 이것은 적혈구와 대부분의 다형핵 백혈구 또는 과립구가 고갈된 인터페이스에서 단핵 세포 집단을 생성합니다. 말초 혈액 단핵 세포라고 불리는 결과 집단은 주로 림프구와 단핵구로 구성됩니다. 희석된 항응고 혈액을 20ºC에서 30분 동안 400g에서 Ficoll 및 원심분리기 위에 쌓습니다(느린 가속, 브레이크 없음). 적혈구, 다형핵 백혈구 또는 과립구는 Ficoll에서 더 높은 밀도를 가지며 튜브 바닥에 있습니다. 그러나 일부 단핵구와 함께 림프구로 구성된 단핵 세포는 그 위에 밴드를 형성하고 경계면에서 회수될 수 있습니다. Ficoll과 혈소판을 제거하기 위해 세포를 1mM EDTA가 포함된 1xPBS를 사용하여 3회 세척합니다.

항체 라벨링

항-CD3-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트), 항-CD8-PE(피코에리트린), 항-CD4-PE, 항-IFN-γ 및 항-IL-4, 항-CD4, 항-CD8 및 대조군 IgG-FITC 및 -PE는 세포 라벨링에 사용됩니다. Fluorescein의 반응성 유도체인 Fluorescein isothiocyanate(FITC)는 다양한 응용 분야를 위한 새로운 형광 분자를 생성하기 위해 다른 비형광 분자에 화학적으로 부착된 가장 일반적인 형광단 중 하나였습니다. DAKO 시스템이 사용됩니다. 염색을 위해 제조업체의 지침에 따라 DAKO 키트로 세포원심분리로 Superfrost Plus 슬라이드에 세포를 도말한 후 면역화학을 사용합니다.

면역조직화학

림프구는 포르볼 12-미리스테이트 13 아세테이트, 25 ng/mL의 존재 하에 10% 소 태아 혈청에서 RPMI-1640의 24-웰 플레이트에서 자극될 것입니다; 이오노마이신; 1μmol; 및 Brefeldin A, 10µg/mL(Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). 자극된 현탁액 150 μL의 세포원심분리를 사용하여 사이토스핀을 만들고 -80°C에서 보관합니다. 약 175,000개의 세포가 염색하기에 충분한 림프구가 있는 각 슬라이드에서 세포분리됩니다. CD8+IFN-+, CD8+IFN-+(또는 CD4+IFN-+, CD4+IFN-+)의 결정 및 측정을 위한 이중 면역세포화학적 방법은 두 단계로 수행됩니다. 1단계에서는 1차 항CD8(또는 각각 항CD4) 마우스 항인간 단일클론 항체와 이차 토끼 항마우스 IgG-FITC 항체를 사용합니다. 2단계에서, 투과화 후, 1차 항-IFN- 또는 IL-4 마우스 항-인간 단클론 항체(Caltag; Burlingame, CA)와 2차 토끼 항-마우스 IgG-PE. 제조업체(Dako)의 지침에 따라 투과성 키트를 사용합니다. 각 비율의 추정을 위해, 500 T 세포는 필요한 경우 염색된 > 10 시토스핀을 계산합니다. 왜냐하면 이 숫자는 계산된 세포 수를 더 늘린 후에도 일정하게 유지되는 피험자당 평균 값을 얻기에 충분하기 때문입니다.

유세포 분석

상기 기술된 바와 같이 제조된 샘플을 형광 활성화 세포측정기(EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK)에서 분석하였다. 림프구는 정방향(0o) 및 측면 광 산란(90o) 모드에서 부피와 복잡성에 의해 밀접하게 게이팅되었습니다. Phycocyanate-conjugated anti-human CD45 monoclonal antibody (DAKO; Ely, UK)는 논리적 게이팅에 의한 비 백혈구 사건을 배제하기 위해 pan-leukocyte 얼룩으로 사용될 것입니다. 1색, 2색 및 3색 양성 세포의 백분율을 측정하고 평균 채널 값과 항원 밀도 wii에 해당하는 상대 형광 강도(RFI)를 추정합니다. 항체 결합의 정량화를 위해 QC-Combo Kit(FCSC; San Jun, Puerto Rico)를 사용할 것이다.

통계 분석

수치 매개변수의 정규성은 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 테스트됩니다. 비모수적 결과에 대한 Wilcoxon 부호 순위 테스트 및 매개변수 결과에 대한 대응 t 테스트는 두 가지 다른 시점(안정 상태 및 악화 시)의 데이터 비교에 사용됩니다. 통계 소프트웨어(SPSS 버전 11.0; SPSS; Chicago, IL)가 분석에 사용됩니다.