Ventilaattoriin liittyvä keuhkokuume (VAP) tehohoitoyksikössä (ICU)

JOHDANTO

Ventilaattoriin liittyvä keuhkokuume (VAP) viittaa tyypillisesti sairaalakeuhkokuumeeseen, joka kehittyy 48 tuntia myöhemmin endotrakeaalisesta intubaatiosta ja mekaanisesta ventilaatiosta. Mekaanista ventilaatiota saavilla ICU-potilailla on neljä kertaa suurempi riski sairastua keuhkokuumeeseen, 3 % päivässä 7. päivän jälkeen. teho-osastolla. Useiden riskitekijöiden on raportoitu liittyvän VAP:iin, mukaan lukien mekaanisen ventilaation kesto, krooninen keuhkosairaus, sepsis, akuutti hengitysvaikeusoireyhtymä (ARDS), neurologinen sairaus ja trauma. Immuunijärjestelmä suojaa isäntää infektioita vastaan. Suojaava immuniteetti voidaan jakaa synnynnäiseen ja adaptiiviseen immuniteettiin. Luontainen immuunivaste kehittyy ensimmäisenä puolustusesteenä isännässä ja muodostaa välittömän, mutta epäspesifisen immuunivasteen tuhotakseen tai rajoittaakseen hyökkääjät nopeasti. Luontaisia ​​puolustusmekanismeja ovat ulkoinen epiteeli, limakalvopinnat, solut (NK-solut, fagosyytit) ja komplementtijärjestelmä.

Mukautuva immuniteetti on toisen linjan puolustus, joka sisältää T (solujen) ja B (humoraalisen) soluvälitteiset vasteet. Tämä on spesifinen, kohdistuu vain taudinaiheuttajiin, ei itseensä, ja sillä on muisti, joka ylläpitää pitkäkestoista immuniteettia uudelleentartuntaa vastaan. Vaikka synnynnäiseltä immuunijärjestelmältä puuttuu adaptiivisen immuniteetin hieno spesifisyys, se pystyy erottamaan itsensä ei-itsestä. Synnynnäistä immuunitunnistusta välittää ituradan koodaamien reseptorien järjestelmä, nimeltään kuviontunnistusreseptorit (PRR), jotka tunnistavat konservoituneita molekyylikuvioita (patogeeneihin liittyvät molekyylimallit, PAMP:t), jotka liittyvät mikrobipatogeeneihin. Nämä reseptorit on kytketty signaalinvälitysreitteihin, jotka säätelevät useiden erilaisten indusoituvien immuunivastegeenien ilmentymistä.

TLR:t hallitsevat sekä synnynnäisiä että adaptiivisia immuunivasteita. TLR-indusoitu tulehdusvaste on riippuvainen yhteisestä signalointireitistä, jota välittää adapterimolekyyli MyD88. TLR-ilmentymistä havaitaan useissa soluissa, kuten makrofageissa, neutrofiileissä, dendriittisoluissa, suolistosta, keuhkoista ja ihosta peräisin olevissa epiteelisoluissa, B- ja T-lymfosyyteissä. TLR4 oli ensimmäinen tunnistettu nisäkkään TLR, joka osallistuu lipopolysakkaridin tunnistamiseen. (LPS), gramnegatiivisten bakteerien tärkein soluseinäkomponentti, joka voi aiheuttaa sepsiksen. TLR2 on tehokkain reseptori ja tunnistaa laajan valikoiman PAMP:ita bakteereista, hiivasta, sienistä, loisista ja viruksista. TLR9 tunnistaa bakteeri-DNA:ssa läsnä olevat metyloitumattomat CpG-motiivit.

Sepsis-oireyhtymä vaikeutuu usein sairaalainfektioiden, erityisesti gramnegatiivisen keuhkokuumeen, kehittymisen vuoksi. Löydökset osoittavat, että TLR9 toimii tärkeänä signaalina luontaisten suojaavien vasteiden synnyttämisessä keuhkojen bakteeripatogeeneille ja sitä tarvitaan tehokkaille synnynnäisille immuunivasteille gramnegatiivisia bakteeripatogeenejä vastaan. Metyloimattomat CpG-motiivit ovat yleisiä bakteerien muttei selkärankaisten genomisessa DNA:ssa. CpG-motiivien tunnistaminen aktivoi isännän puolustusmekanismeja, jotka johtavat synnynnäisiin ja hankittuihin immuunivasteisiin. Solut, jotka ekspressoivat TLR-9:ää, ovat plasmasytoidut dendriittisolut (PDC) ja B-solut, ja sen seurauksena tuottavat Th1:n kaltaisia ​​proinflammatorisia sytokiinejä, interferoneja ja kemokiineja. TLR-9:n aktivaatio indusoi a) sytokiinien (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferonin (IFN)-y:n ja tuumorinekroositekijän (TNF-)α:n, jotka ovat Th1 proinflammatorisia sytokiineja. ja b) IL-10 ja IL-4, jotka ovat Th2 proinflammatorisia sytokiineja, jotka indusoivat immunosuppressiota.

Th1-sytokiineilla on keskeinen rooli makrofagien, NK-solujen ja neutrofiilien tulehduksessa ja aktivoinnissa. Th2-sytokiinit estävät Th1-immuunivasteen. Tämä aiheuttaa systeemisen systeemisen tulehdusvasteen oireyhtymän. Myös maksun kaltaiset reseptorit-2 (TLR2) ja -4 (TLR4) ovat ratkaisevassa asemassa kroonisessa obstruktiivisessa keuhkosairaudessa (COPD). Niiden Gram (-)- ja Gram (+) -bakteerien aktivoituminen LPS:llä johtaa neutrofiilien, NK-solujen, T-, B-solujen ja tulehdussytokiinien aktivoitumiseen. Kroonisissa sairauksissa säätelemätön tulehdus pitää nämä järjestelmät jatkuvassa aktivoitumistilassa, mikä voi mahdollisesti johtaa kudosvaurioon ja etenevään sairauteen. TLR-järjestelmän ymmärtämisen pitäisi tarjota korvaamaton tilaisuus manipuloida isännän immuunivasteita.

TAVOITTEET

1. Tutkia ja selvittää CD4+ και CD8+ Τ lymfosyyttien roolia VAP:n patogeneesissä. Myös sytokiinien IL-4 ja IFN-y taso aika, jolloin teho-osastolla oleville potilaille kehittyy VAP ja muutokset Τ-lymfosyyttien alapopulaatioissa.
2. Arvioida makrofagien apoptoosia ja niiden fagosyyttikykyä VAP-potilailla.
3. Tutkia TLR-2-, TLR-4- ja TLR-9-geenien ilmentymistä ja mahdollisia polymorfismeja.

Immuunivasteen ymmärtäminen VAP:lle mahdollistaa immunoterapian protokollien laatimisen immunologisen vasteen säätelemiseksi.

MENETELMÄT

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Bronkoalveolaarinen huuhtelukäsittely

Ensimmäisenä päivänä jokaiselta potilaalta otetaan verinäytteet, bronkoalveolaarinen huuhtelu (BAL) ja trakeobronkiaalinen aspiraatti (TBA). Bronkoskopia on hengitysteiden sisäpuolen visualisointitekniikka diagnostisia ja terapeuttisia tarkoituksia varten. Bronkoskooppi työnnetään hengitysteihin, yleensä nenän tai suun kautta tai toisinaan trakeostoman kautta. Tämän ansiosta lääkäri voi tutkia potilaan hengitysteitä poikkeavuuksien, kuten vieraiden esineiden, verenvuodon, kasvainten tai tulehduksen varalta. Näytteitä voidaan ottaa keuhkojen sisältä: biopsiat, neste (keuhkoalveolaarinen huuhtelu) tai endobronkiaalinen harjaus. BAL suoritetaan tyypillisesti keuhkosairauden diagnosoimiseksi. Erityisesti BAL:ia käytetään yleisesti infektioiden diagnosointiin ihmisillä, joilla on immuunijärjestelmäongelmia, keuhkokuumeita hengityskoneilla ja joidenkin keuhkosyöpätyyppien diagnosointiin. BAL:ia käytetään usein immunologisessa tutkimuksessa keinona ottaa näytteitä soluista tai patogeenipitoisuuksista keuhkoissa (T-solupopulaatiot). Näytteet voidaan ottaa uudelleen 48 tunnin kuluttua VAP-diagnoosista. BAL asetetaan 10 % FBS-RPMIc:hen ja sentrifugoidaan 400 g:ssä 5 min ja sitten lisätään RPMI-1640 ja 10 % FBS. Solujen lukumäärä ja tyyppi määritetään Μay-Grunwald-Giemsa-värjäyksellä ja alapopulaatiot virtaussytometrialla.

PBMC-eristys

Ihmisen lymfosyytit voidaan eristää helpoimmin ääreisverestä tiheyssentrifugoinnilla hiilihydraattipolymeerillä Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Tämä tuottaa rajapinnalla mononukleaaristen solujen populaation, josta on poistettu punasolut ja useimmat polymorfonukleaariset leukosyytit tai granulosyytit. Tuloksena oleva populaatio, jota kutsutaan perifeerisen veren mononukleaarisoluiksi, koostuu pääasiassa lymfosyyteistä ja monosyyteistä. Laimennettu antikoaguloitu veri kerrostetaan Ficollin päälle ja sentrifugoidaan 400 g, 30 min 20 ºC:ssa (hidas kiihtyvyys, ei jarrua). Punasoluilla, polymorfonukleaarisilla leukosyyteillä tai granulosyyteillä on suurempi tiheys Ficollista ja ne ovat putken pohjalla. Mutta yksitumaiset solut, jotka koostuvat lymfosyyteistä yhdessä joidenkin monosyyttien kanssa, nauhat sen yli ja voidaan ottaa talteen rajapinnalta. Solut pestään käyttäen 1 x PBS:ää 1 mM EDTA:n kanssa 3 kertaa Ficollin ja verihiutaleiden poistamiseksi.

Vasta-aineiden merkitseminen

Anti-CD3-FITC (fluoreseiini-isotiosyanaatti), anti-CD8-PE (fykoerytriini), anti-CD4-PE, anti-IFN-y ja anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 ja kontrolli IgG-FITC ja -PE:tä käytetään solujen leimaamiseen. Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), fluoreseiinin reaktiivinen johdannainen, on ollut yksi yleisimmistä fluoroforeista, jotka on kemiallisesti kiinnitetty muihin, ei-fluoresoiviin molekyyleihin luomaan uusia fluoresoivia molekyylejä erilaisiin sovelluksiin. DAKO-järjestelmää käytetään. Värjäämiseen käytetään immunokemiaa sen jälkeen, kun solut on maljattu Superfrost Plus -laseille sytosentrifugoimalla DAKO-sarjan kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Immunohistokemia

Lymfosyyttejä stimuloidaan 24-kuoppaisilla levyillä RPMI-1640:ssä 10 %:lla vasikan sikiön seerumia forboli-12-myristaatti-13-asetaatin läsnä ollessa, 25 ng/ml; ionomysiini; 1 umol; ja Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Sytospinit valmistetaan sytosentrifugoimalla 150 ui stimuloitua suspensiota ja säilytetään -80 °C:ssa. Noin 175 000 solua sytoskopataan jokaiselta objektilasilta, joiden lymfosyyttejä on riittävästi värjäytymiseen. Kaksois-immunosytokemiallinen menetelmä CD8+IFN-+:n, CD8+IFN-+:n (tai CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) määrittämiseksi ja mittaamiseksi suoritetaan kahdessa vaiheessa. Vaiheessa yksi käytä primaarista anti-CD8 (tai anti-CD4, vastaavasti) hiiren anti-ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta sekundaarisen kanin anti-hiiri-IgG-FITC-vasta-aineen kanssa. Vaiheessa kaksi, permeabilisoinnin jälkeen, primaarinen anti-IFN- tai IL-4-hiiren monoklonaalinen anti-ihminen vasta-aine (Caltag; Burlingame, CA) sekundaarisen kanin anti-hiiri-IgG-PE:n kanssa. Permeabilisointisarjaa käytetään valmistajan (Dako) ohjeiden mukaisesti. Kunkin suhteen arvioimiseksi, 500 T-solua, laskemme tarvittaessa > 10 värjättyä sytospinia, koska tämä määrä on riittävä saamaan keskiarvon koehenkilöä kohti, joka pysyy vakiona laskettujen solujen määrän lisäämisen jälkeen.

Virtaussytometrinen analyysi

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut näytteet analysoitiin fluoresenssiaktivoidulla sytometrillä (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Lymfosyytit aidattiin tiukasti tilavuuden ja monimutkaisuuden mukaan eteenpäin (0o) ja sivulta valonsirontatilassa (90o). Fykosyanaattikonjugoituja monoklonaalisia ihmisen CD45:tä vastaan ​​suunnattuja vasta-aineita (DAKO; Ely, UK) käytetään yleisleukosyyttivärjäyksenä muiden kuin leukosyyttisten tapahtumien sulkemiseksi pois loogisen portin avulla. Yksiväristen, kaksiväristen ja kolmiväristen positiivisten solujen prosenttiosuus mitataan ja kanavan keskiarvo sekä suhteellinen fluoresenssin intensiteetti (RFI), joka vastaa antigeenitiheyttä wii, arvioidaan. QC-Combo Kitiä (FCSC; San Jun, Puerto Rico) käytetään vasta-aineen sitoutumisen kvantifiointiin.

Tilastollinen analyysi

Numeeristen parametrien normaaleja testataan Kolmogorov-Smirnov-testillä. Wilcoxonin signed-rank-testiä ei-parametrisille tuloksille ja parillista t-testiä parametrisille tuloksille käytetään tietojen vertailuun kahdessa eri ajankohdassa (vakaassa tilassa ja pahenemisvaiheessa). Analyysissä käytetään tilastoohjelmistoa (SPSS versio 11.0; SPSS; Chicago, IL).