Pneumonie spojená s ventilátorem (VAP) na jednotce intenzivní péče (JIP)

ÚVOD

Ventilator-associated pneumonia (VAP) typicky označuje nozokomiální pneumonii, která se vyvine o 48 hodin později po endotracheální intubaci a mechanické ventilaci. Pacienti na JIP, kteří podstupují mechanickou ventilaci, mají 4krát vyšší riziko rozvoje pneumonie s mírou 3 % za den po 7. jednotka intenzivní péče. Bylo hlášeno několik rizikových faktorů spojených s VAP, včetně délky trvání mechanické ventilace, přítomnosti chronického plicního onemocnění, sepse, syndromu akutní respirační tísně (ARDS), neurologického onemocnění a traumatu. Imunitní systém chrání hostitele před infekcí. Ochrannou imunitu můžeme rozdělit na vrozenou a adaptivní imunitu. Vrozená imunitní odpověď se vyvíjí jako první obranná bariéra v hostiteli a vyvolává okamžitou, ale nespecifickou imunitní odpověď, aby rychle zničila nebo omezila vetřelce. Vrozenými obrannými mechanismy jsou vnější epitely, povrchy sliznic, buňky (NK buňky, fagocyty) a systém komplementu.

Adaptivní imunita je druhá linie obrany, která zahrnuje reakce zprostředkované T (buněčnými) a B (humorálními) buňkami. To je specifické, zaměřuje se pouze na patogeny a ne na sebe, a má paměť pro udržení dlouhodobé imunity proti reinfekci. I když vrozený imunitní systém postrádá jemnou specifičnost adaptivní imunity, dokáže rozlišit sebe sama od sebe sama. Přirozené imunitní rozpoznávání je zprostředkováno systémem zárodečně kódovaných receptorů nazývaných receptory rozpoznávání vzorů (PRR), které rozpoznávají konzervované molekulární vzory (patogeny asociované molekulární vzory, PAMP), které jsou spojeny s mikrobiálními patogeny. Tyto receptory jsou spojeny s dráhami přenosu signálu, které řídí expresi různých indukovatelných genů imunitní odpovědi.

TLR řídí vrozené i adaptivní imunitní reakce. Zánětlivá reakce vyvolaná TLR je závislá na společné signální dráze, která je zprostředkována adaptorovou molekulou MyD88. Exprese TLR je pozorována v různých buňkách, jako jsou makrofágy, neutrofily, dendritické buňky, epiteliální buňky odvozené ze střeva, plic a kůže, B- a T-lymfocyty. TLR4 byl první identifikovaný savčí TLR a podílí se na rozpoznávání lipopolysacharidů. (LPS), hlavní složka buněčné stěny gramnegativních bakterií, která může vyvolat sepsi. TLR2 je nejsilnější receptor a rozpoznává širokou škálu PAMP z bakterií, kvasinek, hub, parazitů a virů. TLR9 rozpoznává nemethylované CpG motivy přítomné v bakteriální DNA.

Syndrom sepse je často komplikován rozvojem nozokomiálních infekcí, zejména gramnegativní pneumonie. Zjištění naznačují, že TLR9 slouží jako důležitý signál při vytváření ochranných vrozených odpovědí na bakteriální patogeny plic a je nezbytný pro účinné vrozené imunitní odpovědi proti gramnegativním bakteriálním patogenům. Nemethylované CpG motivy převládají v bakteriální genomové DNA, ale nikoli v genomové DNA obratlovců. Rozpoznání CpG motivů aktivuje obranné mechanismy hostitele vedoucí k vrozeným a získaným imunitním odpovědím. Buňky, které exprimují TLR-9, jsou plazmacytoidní dendritické buňky (PDC) a B buňky a v důsledku toho produkují prozánětlivé cytokiny podobné Th1, interferony a chemokiny. Aktivace TLR-9 indukuje produkci a) cytokinů (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferonu (IFN)-γ a tumor nekrotizujícího faktoru (TNF-)α, což jsou Th1 prozánětlivé cytokiny a b) IL-10 a IL-4, což jsou Th2 prozánětlivé cytokiny, které indukují imunosupresi.

Th1 cytokiny hrají ústřední roli při zánětu a aktivaci makrofágů, NK buněk a neutrofilů. Th2 cytokiny inhibují Th1 imunitní odpověď. To způsobuje syndrom systémové systémové zánětlivé reakce. Také toll-like receptory-2 (TLR2) a -4 (TLR4) hrají klíčovou roli u chronické obstrukční plicní nemoci (CHOPN). Jejich aktivace LPS Gram (-) a Gram (+) bakterií vede k aktivaci neutrofilů, NK buněk, T-, B- buněk a zánětlivých cytokinů. U chronického onemocnění dysregulovaný zánět udržuje tyto systémy ve stavu neustálé aktivace, což může mít za následek poškození tkáně a progresivní onemocnění. Pochopení systému TLR by mělo nabídnout neocenitelnou příležitost pro manipulaci s imunitními reakcemi hostitele.

CÍLE

1. Prozkoumat a objasnit roli CD4+ και CD8+ Τ lymfocytů v patogenezi VAP. Také hladina cytokinů IL-4 a IFN-γ v době, kdy se u pacientů na JIP rozvine VAP, a změny v subpopulacích Τ lymfocytů.
2. Vyhodnotit apoptózu makrofágů a jejich schopnost fagocytovat u pacientů s VAP.
3. Studovat expresi a možné polymorfismy genů TLR-2, TLR-4 a TLR-9.

Pochopení imunitní odpovědi na VAP umožní přípravu imunoterapeutických protokolů tak, aby regulovaly imunologickou odpověď.

METODY

MATERIÁLY A METODY

Zpracování bronchoalveolární laváže

První den budou každému pacientovi odebrány vzorky krve, bronchoalveolární laváž (BAL) a tracheobronchiální aspirát (TBA). Bronchoskopie je technika vizualizace vnitřku dýchacích cest pro diagnostické a terapeutické účely. Bronchoskop se zavádí do dýchacích cest, obvykle nosem nebo ústy, nebo příležitostně tracheostomií. To umožňuje lékaři vyšetřit pacientovy dýchací cesty na abnormality, jako jsou cizí tělesa, krvácení, nádory nebo záněty. Vzorky mohou být odebrány zevnitř plic: biopsie, tekutina (bronchoalveolární laváž) nebo endobronchiální kartáčování. BAL se obvykle provádí k diagnostice onemocnění plic. Zejména se BAL běžně používá k diagnostice infekcí u lidí s problémy s imunitním systémem, zápalu plic u lidí na ventilátorech a některých typů rakoviny plic. BAL se často používá v imunologickém výzkumu jako prostředek k odběru vzorků buněk nebo hladin patogenů v plicích (populace T-buněk). Vzorky mohou být znovu odebrány za 48 hodin od diagnózy VAP. BAL se umístí do 10% FBS-RPMIc a odstředí při 400 g, 5 minut, a poté se přidá RPMI-1640 a 10% FBS. Počet a typ buněk bude definován barvením Μay-Grunwald-Giemsa a subpopulace pomocí průtokové cytometrie.

PBMC izolace

Lidské lymfocyty lze nejsnáze izolovat z periferní krve hustotním odstřeďováním s sacharidovým polymerem Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). To poskytuje populaci mononukleárních buněk na rozhraní, která byla ochuzena o červené krvinky a většinu polymorfonukleárních leukocytů nebo granulocytů. Výsledná populace, nazývaná mononukleární buňky periferní krve, se skládá převážně z lymfocytů a monocytů. Zředěná antikoagulovaná krev se navrství na Ficoll a odstředí se při 400 g, 30 minut při 20ºC (pomalá akcelerace, žádná brzda). Červené krvinky, polymorfonukleární leukocyty nebo granulocyty mají vyšší hustotu z Ficollu a jsou na dně zkumavky. Ale mononukleární buňky sestávající z lymfocytů spolu s některými monocyty se přes ni spojují a lze je získat na rozhraní. Buňky se promyjí pomocí 1xPBS s 1mM EDTA 3krát, aby se odstranil Ficoll a krevní destičky.

Značení protilátek

Anti-CD3-FITC (fluorescein isothiokyanát), anti-CD8-PE (fykoerythrin), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ a anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 a kontroly IgG-FITC a -PE bude použit pro značení buněk. Fluorescein isothiokyanát (FITC), reaktivní derivát fluoresceinu, je jedním z nejběžnějších fluoroforů chemicky připojených k jiným nefluorescenčním molekulám za účelem vytvoření nových fluorescenčních molekul pro různé aplikace. Bude použit systém DAKO. K barvení bude použita imunochemie po nanesení buněk na sklíčka Superfrost Plus cytocentrifugací se soupravou DAKO podle pokynů výrobce.

Imunohistochemie

Lymfocyty budou stimulovány na 24jamkových destičkách v RPMI-1640 v 10% fetálním telecím séru v přítomnosti forbol 12-myristát 13 acetátu, 25 ng/ml; ionomycin; 1 umol; a Brefeldin A, 10 ug/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospiny budou vyrobeny pomocí cytocentrifugace 150 ul stimulované suspenze a skladovány při -80 °C. Přibližně 175 000 buněk bude centrifugováno na každém sklíčku, z nichž je dostatek lymfocytů k obarvení. Dvojitá imunocytochemická metoda pro stanovení a měření CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (nebo CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) bude provedena ve dvou krocích. V kroku jedna použijte primární anti-CD8 (nebo anti-CD4, v daném pořadí) myší anti-lidskou monoklonální protilátku se sekundární králičí anti-myší IgG-FITC protilátkou. Ve druhém kroku, po permeabilizaci, primární anti-IFN- nebo IL-4 myší anti-lidská monoklonální protilátka (Caltag; Burlingame, CA) se sekundární králičí anti-myší IgG-PE. Permeabilizační souprava bude použita podle pokynů výrobce (Dako). Pro odhad každého poměru 500 T buněk napočítáme > 10 obarvených cytospinů, pokud je to nutné, protože tento počet je dostatečný k získání střední hodnoty na subjekt, která zůstane konstantní po dalším zvýšení počtu spočítaných buněk.

Průtoková cytometrická analýza

Vzorky připravené, jak je popsáno výše, byly analyzovány na fluorescenčně aktivovaném cytometru (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Lymfocyty byly těsně ohraničeny objemem a složitostí v režimu dopředného (0o) a bočního rozptylu světla (90o). Monoklonální protilátky proti lidskému CD45 konjugované s fykokyanátem (DAKO; Ely, UK) budou použity jako pan-leukocytové barvení k vyloučení neleukocytárních jevů logickým hradlováním. Bude měřeno procento jednobarevných, dvoubarevných a tříbarevných pozitivních buněk a bude odhadnuta střední hodnota kanálu a také relativní intenzita fluorescence (RFI) odpovídající hustotě antigenu wii. Pro kvantifikaci vazby protilátek bude použita sada QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico).

Statistická analýza

Normálnost numerických parametrů bude testována pomocí Kolmogorova-Smirnovova testu. Wilcoxonův znaménkový test pro neparametrické výsledky a párový t test pro parametrické výsledky budou použity pro srovnání dat ve dvou různých časových bodech (ve stabilním stavu a při exacerbaci). Pro analýzu bude použit statistický software (SPSS verze 11.0; SPSS; Chicago, IL).