Вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП) в отделении интенсивной терапии (ОИТ)

ВСТУПЛЕНИЕ

Вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП) обычно относится к нозокомиальной пневмонии, развивающейся через 48 часов после эндотрахеальной интубации и механической вентиляции. отделение интенсивной терапии. Сообщалось о нескольких факторах риска, связанных с ВАП, включая продолжительность искусственной вентиляции легких, наличие хронического заболевания легких, сепсиса, острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), неврологических заболеваний и травм. Иммунная система защищает хозяина от инфекции. Защитный иммунитет можно разделить на врожденный и адаптивный иммунитет. Врожденный иммунный ответ развивается как первый защитный барьер у хозяина и вызывает немедленный, но неспецифический иммунный ответ, чтобы быстро уничтожить или ограничить захватчиков. Врожденными защитными механизмами являются наружный эпителий, поверхности слизистых оболочек, клетки (NK-клетки, фагоциты) и система комплемента.

Адаптивный иммунитет представляет собой вторую линию защиты, которая включает в себя ответы, опосредованные Т (клеточными) и В (гуморальными) клетками. Это специфично, нацелено только на патогены, а не на себя, и обладает памятью для поддержания длительного иммунитета против повторного заражения. Хотя врожденной иммунной системе не хватает тонкой специфичности адаптивного иммунитета, она может отличить свое от чужого. Врожденное иммунное распознавание опосредуется системой рецепторов, кодируемых зародышевой линией, называемых рецепторами распознавания образов (PRR), которые распознают консервативные молекулярные паттерны (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, PAMP), которые связаны с микробными патогенами. Эти рецепторы связаны с путями передачи сигнала, которые контролируют экспрессию множества индуцируемых генов иммунного ответа.

TLR контролируют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ. TLR-индуцированный воспалительный ответ зависит от общего сигнального пути, который опосредован адапторной молекулой MyD88. Экспрессия TLR наблюдается в различных клетках, таких как макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эпителиальные клетки, полученные из кишечника, легких и дермы, В- и Т-лимфоциты. TLR4 был первым идентифицированным TLR млекопитающих и участвует в распознавании липополисахарида (LPS), основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который может вызывать сепсис. TLR2 является самым мощным рецептором и распознает широкий спектр PAMP бактерий, дрожжей, грибков, паразитов и вирусов. TLR9 распознает неметилированные мотивы CpG, присутствующие в бактериальной ДНК.

Синдром сепсиса часто осложняется развитием внутрибольничных инфекций, особенно грамотрицательной пневмонии. Полученные данные показывают, что TLR9 служит важным сигналом в формировании защитных врожденных ответов на бактериальные патогены легких и необходим для эффективных врожденных иммунных ответов против грамотрицательных бактериальных патогенов. Неметилированные мотивы CpG преобладают в геномной ДНК бактерий, но не позвоночных. Распознавание мотивов CpG активирует защитные механизмы хозяина, приводящие к врожденным и приобретенным иммунным ответам. Клетки, которые экспрессируют TLR-9, представляют собой плазмоцитоидные дендритные клетки (PDC) и В-клетки и, как следствие, продуцируют Th1-подобные провоспалительные цитокины, интерфероны и хемокины. Активация TLR-9 индуцирует выработку а) цитокинов (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), интерферона (IFN)-γ и фактора некроза опухоли (TNF-)α, которые являются провоспалительными цитокинами Th1. и b) IL-10 и IL-4, которые представляют собой провоспалительные цитокины Th2, вызывающие иммуносупрессию.

Цитокины Th1 играют центральную роль в воспалении и активации макрофагов, NK-клеток и нейтрофилов. Цитокины Th2 ингибируют иммунный ответ Th1. Это вызывает синдром системной системной воспалительной реакции. Кроме того, толл-подобные рецепторы-2 (TLR2) и -4 (TLR4) играют решающую роль при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Их активация ЛПС грам(-) и грам(+) бактерий приводит к активации нейтрофилов, NK-клеток, Т-, В-клеток и воспалительных цитокинов. При хроническом заболевании нарушение регуляции воспаления поддерживает эти системы в состоянии постоянной активации, что может привести к повреждению тканей и прогрессированию заболевания. Понимание системы TLR должно предоставить неоценимую возможность для манипулирования иммунными реакциями хозяина.

ЦЕЛИ

1. Изучение и выяснение роли CD4+ και CD8+ Τ Т-лимфоцитов в патогенезе ВАП. Также определяли уровень цитокинов ИЛ-4 и ИФН-γ, сроки развития ВАП у больных в ОИТ и изменения субпопуляций Т-лимфоцитов.
2. Оценить апоптоз макрофагов и их способность к фагоцитированию у больных ВАП.
3. Изучить экспрессию и возможные полиморфизмы генов TLR-2, TLR-4 и TLR-9.

Понимание иммунного ответа на VAP позволит подготовить протоколы иммунотерапии, чтобы регулировать иммунологический ответ.

МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обработка бронхоальвеолярного лаважа

В первый день у каждого пациента будут взяты образцы крови, бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и трахеобронхиального аспирата (ТБА). Бронхоскопия — это метод визуализации внутренней части дыхательных путей в диагностических и терапевтических целях. Бронхоскоп вводится в дыхательные пути, обычно через нос или рот, иногда через трахеостому. Это позволяет практикующему врачу обследовать дыхательные пути пациента на наличие аномалий, таких как инородные тела, кровотечение, опухоли или воспаление. Образцы могут быть взяты изнутри легких: биопсия, жидкость (бронхоальвеолярный лаваж) или эндобронхиальная чистка. БАЛ обычно проводится для диагностики заболеваний легких. В частности, БАЛ обычно используется для диагностики инфекций у людей с проблемами иммунной системы, пневмонии у людей на искусственной вентиляции легких и некоторых видов рака легких. БАЛ часто используется в иммунологических исследованиях как средство отбора проб клеток или уровней патогенов в легких (популяции Т-клеток). Образцы могут быть взяты повторно через 48 часов после постановки диагноза ВАП. BAL помещают в 10% FBS-RPMIc и центрифугируют при 400 г, 5 мин, а затем добавляют RPMI-1640 и 10% FBS. Количество и тип клеток будут определять с помощью окрашивания по Мей-Грюнвальду-Гимзе, а субпопуляции - с помощью проточной цитометрии.

Изоляция РВМС

Лимфоциты человека легче всего выделить из периферической крови путем центрифугирования в плотности с углеводным полимером фиколлом (Ficoll Histopaque, Sigma, кат. 1077-1). Это дает популяцию мононуклеарных клеток на границе раздела, обедненную эритроцитами и большинством полиморфноядерных лейкоцитов или гранулоцитов. Образовавшаяся популяция, называемая мононуклеарными клетками периферической крови, состоит в основном из лимфоцитов и моноцитов. Разбавленную антикоагулированную кровь наслаивают на Фиколл и центрифугируют при 400 g, 30 мин при 20°C (медленное ускорение, без торможения). Эритроциты, полиморфноядерные лейкоциты или гранулоциты имеют более высокую плотность от фиколла и находятся на дне пробирки. Но мононуклеарные клетки, состоящие из лимфоцитов вместе с некоторыми моноцитами, располагаются над ней и могут быть восстановлены на границе раздела. Клетки 3 раза промывают 1×PBS с 1 мМ ЭДТА для удаления фиколла и тромбоцитов.

Маркировка антител

Анти-CD3-FITC (изотиоцианат флуоресцеина), анти-CD8-PE (фикоэритрин), анти-CD4-PE, анти-IFN-γ и анти-IL-4, анти-CD4, анти-CD8 и контрольные IgG-FITC и -PE будет использоваться для маркировки ячеек. Изотиоцианат флуоресцеина (FITC), реактивное производное флуоресцеина, был одним из наиболее распространенных флуорофоров, химически присоединенных к другим нефлуоресцентным молекулам для создания новых флуоресцентных молекул для различных применений. Будет использоваться система DAKO. Для окрашивания будет использоваться иммунохимия после посева клеток на предметные стекла Superfrost Plus путем цитоцентрифугирования с помощью набора DAKO в соответствии с инструкциями производителя.

Иммуногистохимия

Лимфоциты будут стимулировать в 24-луночных планшетах в RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой в ​​присутствии ацетата форбола 12-миристата 13, 25 нг/мл; иономицин; 1 мкмоль; и Брефельдин А, 10 мкг/мл (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, Миссури). Цитоспины получают с помощью цитоцентрифугирования 150 мкл стимулированной суспензии и хранят при температуре -80°C. Приблизительно 175 000 клеток будут подвергнуты цитоспрядению на каждом предметном стекле, из которых достаточно лимфоцитов для окрашивания. Двойной иммуноцитохимический метод определения и измерения CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (или CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) будет выполняться в два этапа. На первом этапе используйте первичное анти-CD8 (или анти-CD4, соответственно) мышиное моноклональное антитело против человека со вторичным кроличьим антителом против мышиного IgG-FITC. На втором этапе, после пермеабилизации, первичное мышиное моноклональное антитело против IFN или IL-4 против человека (Caltag; Burlingame, CA) с вторичным кроличьим антителом против IgG-PE мыши. Комплект пермеабилизации будет использоваться в соответствии с инструкциями производителя (Dako). Для оценки каждого отношения 500 Т-клеток мы подсчитываем > 10 окрашенных цитоспинов, если это необходимо, потому что этого количества достаточно для получения среднего значения на субъекта, которое остается постоянным после дальнейшего увеличения количества подсчитываемых клеток.

Проточный цитометрический анализ

Образцы, приготовленные, как описано выше, анализировали на флуоресцентно-активированном цитометре (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Лимфоциты были плотно закрыты по объему и сложности в режиме прямого (0°) и бокового светорассеяния (90°). Моноклональные антитела против человеческого CD45, конъюгированные с фикоцианатом (DAKO; Эли, Великобритания), будут использоваться в качестве пан-лейкоцитарного окрашивания для исключения нелейкоцитарных явлений путем логического гейтирования. Измеряют процент одноцветных, двухцветных и трехцветных положительных клеток и оценивают среднее значение канала, а также относительную интенсивность флуоресценции (RFI), соответствующую плотности антигена. QC-Combo Kit (FCSC; Сан-Джун, Пуэрто-Рико) будет использоваться для количественного определения связывания антител.

Статистический анализ

Нормальность числовых параметров будет проверена с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Критерий знакового ранга Уилкоксона для непараметрических исходов и парный t-критерий для параметрических исходов будут использоваться для сравнения данных в два разных момента времени (при стабильном состоянии и при обострении). Для анализа будет использоваться статистическое программное обеспечение (версия SPSS 11.0; SPSS; Чикаго, Иллинойс).