Polmonite associata al ventilatore (VAP) in unità di terapia intensiva (ICU)

INTRODUZIONE

La polmonite associata al ventilatore (VAP) si riferisce tipicamente alla polmonite nosocomiale che si sviluppa 48 ore dopo dall'intubazione endotracheale e dalla ventilazione meccanica. I pazienti in terapia intensiva che ricevono ventilazione meccanica hanno un rischio 4 volte maggiore di sviluppare polmonite con un tasso del 3% al giorno dopo il giorno 7 in il reparto di terapia intensiva. È stato riportato che diversi fattori di rischio sono associati alla VAP, inclusa la durata della ventilazione meccanica, la presenza di malattie polmonari croniche, sepsi, sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), malattie neurologiche e traumi. Il sistema immunitario difende l'ospite dalle infezioni. L'immunità protettiva può essere suddivisa in immunità innata e adattativa. La risposta immunitaria innata si evolve come una prima barriera di difesa nell'ospite e monta una risposta immunitaria immediata, ma non specifica, per distruggere o limitare rapidamente gli invasori. I meccanismi di difesa innati sono gli epiteli esterni, le superfici mucose, le cellule (cellule NK, fagociti) e il sistema del complemento.

L'immunità adattativa è una seconda linea di difesa che include risposte mediate da cellule T (cellulari) e B (umorali). Questo è specifico, prende di mira solo i patogeni e non il sé, e ha la memoria per sostenere un'immunità di lunga durata contro la reinfezione. Sebbene il sistema immunitario innato manchi della sottile specificità dell'immunità adattativa, può distinguere il sé dal non sé. Il riconoscimento immunitario innato è mediato da un sistema di recettori codificati nella linea germinale denominati recettori di riconoscimento del modello (PRR) che riconoscono i modelli molecolari conservati (modelli molecolari associati ai patogeni, PAMP) che sono associati ai patogeni microbici. Questi recettori sono accoppiati a vie di trasduzione del segnale che controllano l'espressione di una varietà di geni inducibili di risposta immunitaria.

I TLR controllano le risposte immunitarie sia innate che adattative. La risposta infiammatoria indotta da TLR dipende da una via di segnalazione comune mediata dalla molecola dell'adattatore MyD88. L'espressione di TLR è osservata in una varietà di cellule come macrofagi, neutrofili, cellule dendritiche, cellule epiteliali derivate da intestino, polmone e derma, linfociti B e T. TLR4 è stato il primo TLR di mammifero identificato ed è coinvolto nel riconoscimento del lipopolisaccaride (LPS), un importante componente della parete cellulare dei batteri Gram-negativi che può indurre sepsi. TLR2 è il recettore più potente e riconosce un'ampia varietà di PAMP da batteri, lieviti, funghi, parassiti e virus. TLR9 riconosce i motivi CpG non metilati presenti nel DNA batterico.

La sindrome sepsi è spesso complicata dallo sviluppo di infezioni nosocomiali, in particolare polmonite da Gram-negativi. I risultati indicano che TLR9 funge da segnale importante nella generazione di risposte innate protettive ai patogeni batterici del polmone e che è necessario per risposte immunitarie innate efficaci contro i patogeni batterici Gram-negativi. I motivi CpG non metilati sono prevalenti nel DNA genomico batterico ma non nei vertebrati. Il riconoscimento dei motivi CpG attiva i meccanismi di difesa dell'ospite che portano a risposte immunitarie innate e acquisite. Le cellule che esprimono TLR-9 sono le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) e le cellule B e di conseguenza producono citochine proinfiammatorie simili a Th1, interferoni e chemochine. L'attivazione di TLR-9 induce la produzione di a) citochine (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferone (IFN)-γ e fattore di necrosi tumorale (TNF-)α che sono citochine proinfiammatorie Th1 e b) IL-10 e IL-4 che sono citochine proinfiammatorie Th2 che inducono immunosoppressione.

Le citochine Th1 svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione e nell'attivazione di macrofagi, cellule NK e neutrofili. Le citochine Th2 inibiscono la risposta immunitaria Th1. Ciò causa una sindrome da risposta infiammatoria sistemica sistemica. Inoltre, i recettori toll-like-2 (TLR2) e -4 (TLR4) svolgono un ruolo cruciale nella broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). La loro attivazione da parte di LPS di batteri Gram (-) e Gram (+) porta all'attivazione di neutrofili, cellule NK, cellule T, B e citochine infiammatorie. Nella malattia cronica, l'infiammazione disregolata mantiene questi sistemi in uno stato di costante attivazione, con potenziale conseguente danno tissutale e malattia progressiva. La comprensione del sistema TLR dovrebbe offrire un'opportunità inestimabile per manipolare le risposte immunitarie dell'ospite.

OBIETTIVI

1. Indagare e chiarire il ruolo dei linfociti CD4+ και CD8+ Τ nella patogenesi della VAP. Inoltre, il livello delle citochine IL-4 e IFN-γ il momento in cui i pazienti in terapia intensiva sviluppano VAP e le modifiche alle sottopopolazioni di linfociti Τ.
2. Valutare l'apoptosi dei macrofagi e la loro capacità di fagocitare in pazienti con VAP.
3. Studiare l'espressione e gli eventuali polimorfismi dei geni TLR-2, TLR-4 e TLR-9.

La comprensione della risposta immunitaria alla VAP consentirà la preparazione di protocolli di immunoterapia in modo da regolare la risposta immunologica.

METODI

MATERIALI E METODI

Elaborazione del lavaggio broncoalveolare

Il primo giorno, in ogni paziente verranno prelevati campioni di sangue, lavaggio broncoalveolare (BAL) e aspirato tracheobronchiale (TBA). La broncoscopia è una tecnica di visualizzazione dell'interno delle vie aeree per scopi diagnostici e terapeutici. Un broncoscopio viene inserito nelle vie aeree, di solito attraverso il naso o la bocca, o occasionalmente attraverso una tracheostomia. Ciò consente al medico di esaminare le vie aeree del paziente per anomalie come corpi estranei, sanguinamento, tumori o infiammazioni. I campioni possono essere prelevati dall'interno dei polmoni: biopsie, fluido (lavaggio broncoalveolare) o spazzolamento endobronchiale. Il BAL viene tipicamente eseguito per diagnosticare malattie polmonari. In particolare, il BAL è comunemente usato per diagnosticare infezioni nelle persone con problemi al sistema immunitario, polmonite nelle persone sotto ventilazione e alcuni tipi di cancro ai polmoni. Il BAL è spesso utilizzato nella ricerca immunologica come mezzo per campionare cellule o livelli di agenti patogeni nel polmone (popolazioni di cellule T). I campioni possono essere prelevati nuovamente dopo 48 ore dalla diagnosi di VAP. Il BAL sarà posto in 10%FBS-RPMIc e centrifughe a 400g, 5 min, e poi verrà aggiunto RPMI-1640 e 10% FBS. Il numero e il tipo delle cellule saranno definiti mediante colorazione di Μay-Grunwald-Giemsa, e le sottopopolazioni con citometria a flusso.

Isolamento PBMC

I linfociti umani possono essere isolati più facilmente dal sangue periferico mediante centrifugazione per densità con il polimero di carboidrati Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Ciò produce una popolazione di cellule mononucleate all'interfaccia che è stata impoverita di globuli rossi e la maggior parte dei leucociti o granulociti polimorfonucleati. La popolazione risultante, chiamata cellule mononucleari del sangue periferico, consiste principalmente di linfociti e monociti. Il sangue anticoagulato diluito viene stratificato su Ficoll e centrifugato a 400 g, 30 minuti a 20ºC (accelerazione lenta, nessun freno). Globuli rossi, leucociti polimorfonucleati o granulociti hanno una densità maggiore rispetto a Ficoll e si trovano sul fondo della provetta. Ma le cellule mononucleari costituite da linfociti insieme ad alcuni monociti si legano su di esso e possono essere recuperate all'interfaccia. Le cellule vengono lavate usando 1xPBS con 1 mM EDTA 3 volte per rimuovere Ficoll e piastrine.

Marcatura degli anticorpi

Anti-CD3-FITC (isotiocianato di fluoresceina), anti-CD8-PE (ficoeritrina), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ e anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 e controlli IgG-FITC e -PE verrà utilizzato per etichettare le celle. L'isotiocianato di fluoresceina (FITC), un derivato reattivo della fluoresceina, è stato uno dei fluorofori più comuni attaccati chimicamente ad altre molecole non fluorescenti per creare nuove molecole fluorescenti per una varietà di applicazioni. Verrà utilizzato il sistema DAKO. Per la colorazione, verrà utilizzata l'immunochimica dopo aver placcato le cellule su vetrini Superfrost Plus mediante citocentrifugazione con il kit di DAKO secondo le istruzioni del produttore.

Immunoistochimica

I linfociti saranno stimolati in piastre da 24 pozzetti in RPMI-1640 al 10% di siero di vitello fetale in presenza di forbolo 12-miristato 13 acetato, 25 ng/mL; ionomicina; 1 µmol; e Brefeldin A, 10 µg/mL (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Le citospine saranno ottenute mediante citocentrifugazione di 150 µL della sospensione stimolata e conservate a -80°C. Circa 175.000 cellule saranno sottoposte a cytospun su ogni vetrino, di cui ci sono linfociti sufficienti per la colorazione. Il doppio metodo immunocitochimico per la determinazione e la misurazione di CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (o CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) sarà eseguito in due fasi. Nella prima fase, utilizzare l'anticorpo monoclonale anti-umano anti-topo primario anti-CD8 (o anti-CD4, rispettivamente) con l'anticorpo IgG-FITC anti-topo secondario di coniglio. Nella fase due, dopo la permeabilizzazione, un anticorpo monoclonale anti-umano di topo primario anti-IFN o IL-4 (Caltag; Burlingame, CA) con IgG-PE di coniglio anti-topo secondario. Verrà utilizzato un kit di permeabilizzazione secondo le istruzioni del produttore (Dako). Per la stima di ciascun rapporto, 500 cellule T contiamo > 10 cytospin colorati se necessario perché questo numero è sufficiente per ottenere un valore medio per soggetto che rimane costante dopo aver ulteriormente aumentato il numero di cellule contate.

Analisi citometrica a flusso

I campioni preparati come descritto sopra sono stati analizzati su un citometro attivato a fluorescenza (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). I linfociti erano strettamente gated per volume e complessità in una modalità di diffusione della luce in avanti (0o) e laterale (90o). Anticorpi monoclonali anti-CD45 umani coniugati con ficocianato (DAKO; Ely, UK) saranno utilizzati come colorazione pan-leucocitaria per escludere eventi non leucocitari mediante gating logico. Verrà misurata la percentuale di cellule positive monocolore, bicolore e tricolore e verrà stimato il valore medio del canale e l'intensità relativa di fluorescenza (RFI) corrispondente alla densità dell'antigene. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Porto Rico) sarà utilizzato per la quantificazione del legame anticorpale.

Analisi statistica

La normalità dei parametri numerici sarà verificata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov. Il test dei ranghi con segno di Wilcoxon per gli esiti non parametrici e il test t accoppiato per gli esiti parametrici saranno utilizzati per confrontare i dati in due diversi punti temporali (in condizioni stabili e in esacerbazione). Il software statistico (SPSS versione 11.0; SPSS; Chicago, IL) verrà utilizzato per l'analisi.