Pneumonia Associada à Ventilação (PAV) em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)

INTRODUÇÃO

A pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) geralmente se refere à pneumonia nosocomial que se desenvolve 48 horas depois da intubação endotraqueal e da ventilação mecânica. a unidade de terapia intensiva. Vários fatores de risco têm sido relatados como associados à PAV, incluindo a duração da ventilação mecânica, a presença de doença pulmonar crônica, sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), doença neurológica e trauma. O sistema imunológico defende o hospedeiro contra infecções. A imunidade protetora pode ser dividida em imunidade inata e adaptativa. A resposta imune inata evolui como uma primeira barreira de defesa no hospedeiro e monta uma resposta imune imediata, mas inespecífica, para destruir ou limitar rapidamente os invasores. Os mecanismos de defesa inatos são o epitélio externo, as superfícies mucosas, as células (células NK, fagócitos) e o sistema complemento.

A imunidade adaptativa é uma defesa de segunda linha que inclui respostas mediadas por células T (celulares) e B (humorais). Isso é específico, tem como alvo apenas patógenos e não o próprio, e tem memória para sustentar uma imunidade duradoura contra a reinfecção. Embora o sistema imunológico inato careça da especificidade da imunidade adaptativa, ele pode distinguir o próprio do não próprio. O reconhecimento imunológico inato é mediado por um sistema de receptores codificados pela linhagem germinativa denominados receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) que reconhecem padrões moleculares conservados (padrões moleculares associados a patógenos, PAMPs) que estão associados a patógenos microbianos. Esses receptores são acoplados a vias de transdução de sinal que controlam a expressão de uma variedade de genes de resposta imune induzíveis.

Os TLRs controlam as respostas imunes inata e adaptativa. A resposta inflamatória induzida por TLR é dependente de uma via de sinalização comum que é mediada pela molécula adaptadora MyD88. A expressão de TLR é observada em uma variedade de células, como macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células epiteliais derivadas do intestino, pulmão e derme, linfócitos B e T. TLR4 foi o primeiro TLR de mamífero identificado e está envolvido no reconhecimento de lipopolissacarídeo (LPS), um dos principais componentes da parede celular de bactérias Gram-negativas que podem induzir a sepse. O TLR2 é o receptor mais poderoso e reconhece uma ampla variedade de PAMPs de bactérias, leveduras, fungos, parasitas e vírus. TLR9 reconhece motivos CpG não metilados presentes no DNA bacteriano.

A síndrome da sepse é frequentemente complicada pelo desenvolvimento de infecções nosocomiais, particularmente pneumonia Gram-negativa. Os achados indicam que o TLR9 serve como um sinal importante na geração de respostas inatas protetoras a patógenos bacterianos do pulmão e que é necessário para respostas imunes inatas eficazes contra patógenos bacterianos Gram-negativos. Os motivos CpG não metilados são predominantes no DNA genômico de bactérias, mas não de vertebrados. O reconhecimento de motivos CpG ativa os mecanismos de defesa do hospedeiro levando a respostas imunes inatas e adquiridas. As células que expressam TLR-9 são as células dendríticas plasmocitóides (PDCs) e as células B e, como consequência, produzem citocinas pró-inflamatórias semelhantes a Th1, interferons e quimiocinas. A ativação de TLR-9 induz a produção de a) citocinas (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-γ e fator de necrose tumoral (TNF-)α, que são citocinas pró-inflamatórias Th1 e b) IL-10 e IL-4 que são citocinas pró-inflamatórias Th2 que induzem imunossupressão.

As citocinas Th1 desempenham um papel central na inflamação e ativação de macrófagos, células NK e neutrófilos. As citocinas Th2 inibem a resposta imune Th1. Isso causa uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica sistêmica. Além disso, os receptores toll-like-2 (TLR2) e -4 (TLR4) desempenham um papel crucial na doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Sua ativação por LPS de bactérias Gram (-) e Gram (+) leva à ativação de neutrófilos, células NK, células T-, B- e citocinas inflamatórias. Na doença crônica, a inflamação desregulada mantém esses sistemas em estado de ativação constante, resultando potencialmente em dano tecidual e doença progressiva. Compreender o sistema TLR deve oferecer uma oportunidade inestimável para manipular as respostas imunes do hospedeiro.

MIRA

1. Investigar e elucidar o papel dos linfócitos CD4+ και CD8+ Τ na patogênese da PAV. Além disso, o nível das citocinas IL-4 e IFN-γ, o tempo em que os pacientes na UTI desenvolvem PAVM e as alterações nas subpopulações de linfócitos Τ.
2. Avaliar a apoptose de macrófagos e sua capacidade de fagocitose em pacientes com PAV.
3. Estudar a expressão e possíveis polimorfismos dos genes TLR-2, TLR-4 e TLR-9.

O entendimento da resposta imune à PAV permitirá a elaboração de protocolos de imunoterapia de modo a regular a resposta imunológica.

MÉTODOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Processamento de lavagem broncoalveolar

No primeiro dia, serão colhidas amostras de sangue, lavado broncoalveolar (LBA) e aspirado traqueobrônquico (TBA) de cada paciente. A broncoscopia é uma técnica de visualização do interior das vias aéreas para fins diagnósticos e terapêuticos. Um broncoscópio é inserido nas vias aéreas, geralmente através do nariz ou da boca, ou ocasionalmente através de uma traqueostomia. Isso permite que o médico examine as vias aéreas do paciente em busca de anormalidades, como corpos estranhos, sangramento, tumores ou inflamação. As amostras podem ser retiradas de dentro dos pulmões: biópsias, fluido (lavado broncoalveolar) ou escovação endobrônquica. BAL é normalmente realizado para diagnosticar doenças pulmonares. Em particular, o BAL é comumente usado para diagnosticar infecções em pessoas com problemas no sistema imunológico, pneumonia em pessoas com ventiladores e alguns tipos de câncer de pulmão. O BAL é freqüentemente usado em pesquisas imunológicas como um meio de amostragem de células ou níveis de patógenos no pulmão (populações de células T). As amostras podem ser coletadas novamente em 48 horas a partir do diagnóstico de PAV. O BAL será colocado em 10%FBS-RPMIc e centrifugado a 400g, 5 min, e em seguida será adicionado RPMI-1640 e 10% FBS. O número e o tipo de células serão definidos por coloração de Μay-Grunwald-Giemsa, e as subpopulações por citometria de fluxo.

Isolamento de PBMC

Linfócitos humanos podem ser isolados mais facilmente do sangue periférico por centrifugação de densidade com o polímero de carboidrato Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Isso produz uma população de células mononucleares na interface que foi depletada de glóbulos vermelhos e da maioria dos leucócitos ou granulócitos polimorfonucleares. A população resultante, chamada de células mononucleares do sangue periférico, consiste principalmente de linfócitos e monócitos. Sangue anticoagulado diluído é colocado em Ficoll e centrifugado a 400g, 30min a 20ºC (aceleração lenta, sem freio). Glóbulos vermelhos, leucócitos polimorfonucleares ou granulócitos têm maior densidade de Ficoll e estão no fundo do tubo. Mas as células mononucleares que consistem em linfócitos junto com alguns monócitos se unem sobre ela e podem ser recuperadas na interface. As células são lavadas usando 1xPBS com 1mM EDTA 3 vezes para remover Ficoll e plaquetas.

Rotulagem de anticorpos

Anti-CD3-FITC (isotiocianato de fluoresceína), anti-CD8-PE (ficoeritrina), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ e anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 e controles IgG-FITC e -PE será usado para rotular as células. O isotiocianato de fluoresceína (FITC), um derivado reativo da fluoresceína, tem sido um dos fluoróforos mais comuns ligados quimicamente a outras moléculas não fluorescentes para criar novas moléculas fluorescentes para uma variedade de aplicações. O sistema DAKO será usado. Para a coloração, será utilizada imunoquímica após plaqueamento das células em lâminas Superfrost Plus por citocentrifugação com o kit da DAKO conforme instruções do fabricante.

imuno-histoquímica

Os linfócitos serão estimulados em placas de 24 poços em RPMI-1640 a 10% de soro fetal bovino na presença de forbol 12-miristato 13 acetato, 25 ng/mL; ionomicina; 1 µmol; e Brefeldin A, 10 µg/mL (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Os Cytospins serão produzidos por citocentrifugação de 150 µL da suspensão estimulada e armazenados a -80°C. Aproximadamente 175.000 células serão citocentradas em cada lâmina, das quais há linfócitos suficientes para corar. O método imunocitoquímico duplo para determinação e dosagem de CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (ou CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) será realizado em duas etapas. Na etapa um, use o anticorpo monoclonal primário anti-CD8 (ou anti-CD4, respectivamente) de camundongo anti-humano com o anticorpo secundário de coelho anti-camundongo IgG-FITC. Na etapa dois, após a permeabilização, um anticorpo monoclonal primário anti-IFN- ou IL-4 de camundongo anti-humano (Caltag; Burlingame, CA) com IgG-PE anti-camundongo de coelho secundário. Será utilizado um kit de permeabilização de acordo com as instruções do fabricante (Dako). Para a estimativa de cada proporção, contamos 500 células T > 10 citospins corados, se necessário, porque esse número é suficiente para obter um valor médio por indivíduo que permanece constante após aumentar ainda mais o número de células contadas.

Análise de Citometria de Fluxo

As amostras preparadas conforme descrito acima foram analisadas em um citômetro ativado por fluorescência (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Os linfócitos foram fortemente controlados por volume e complexidade em um modo de dispersão de luz frontal (0o) e lateral (90o). Anticorpos monoclonais anti-CD45 humano conjugados com ficocianato (DAKO; Ely, Reino Unido) serão usados ​​como coloração pan-leucocitária para excluir eventos não leucocitários por gating lógico. A porcentagem de células positivas monocromáticas, bicolores e tricolores será medida e o valor médio do canal, bem como a intensidade relativa de fluorescência (RFI) correspondente à densidade do antígeno serão estimados. O kit QC-Combo (FCSC; San Jun, Porto Rico) será usado para a quantificação da ligação do anticorpo.

Análise Estatística

A normalidade dos parâmetros numéricos será testada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov. O teste de postos sinalizados de Wilcoxon para desfechos não paramétricos e o teste t pareado para desfechos paramétricos serão usados ​​para comparação dos dados em dois momentos diferentes (na condição estável e na exacerbação). Software estatístico (SPSS versão 11.0; SPSS; Chicago, IL) será usado para análise.