MPNST를 가진 NF1 환자에서 순환하는 종양 혈장 DNA의 마이크로어레이 CGH 분석

서론 신경섬유종증 1형(NF1)은 살아있는 신생아 3,500명 중 1명에서 발생하는 상염색체 우성 장애입니다. 이 질병은 염색체 17q11.2에 위치한 NF1 유전자의 이형접합 돌연변이에 의해 발생합니다. NF1 유전자는 RAS 발암유전자의 음성 조절자인 종양 억제인자 뉴로피브로민을 암호화합니다. 임상적으로 NF1 환자는 카페오레 황반, 주근깨, 리쉬 결절 및 신경섬유종이 있습니다. 인지 문제, 뼈 병변 및 시신경 교종도 이러한 환자들에게 흔합니다.

신경섬유종은 말초 신경초의 양성 신생물로 NF1 환자의 신체 어디에나 나타날 수 있습니다. 신경 섬유종은 슈반 세포, 섬유아세포, 비만 세포 및 신경주위 세포와 같은 다양한 세포 유형으로 구성됩니다. NF1 환자의 Schwann 세포에서 야생형 NF1 대립 유전자가 비활성화되면 신경 섬유종이 형성됩니다. 신경 섬유종에는 피부, 피하 및 플렉시폼의 3가지 유형이 있습니다. 피부 신경섬유종은 청소년기에 각각 피부 안이나 피부 아래에 고립된 결절로 나타납니다. 플렉시형 신경섬유종은 선천성이며 말초 신경의 큰 부분을 따라 퍼질 수 있습니다. 피하 신경섬유종은 말초 신경에 위치한 별개의 결절이며 발생 시기는 알려져 있지 않으나 태아기일 가능성이 높습니다.

모든 NF1 환자는 악성 말초 신경초 종양(MPNST)이 발병할 평생 위험이 8~13%입니다. 이 위험은 NF1 환자의 하위 모집단, 즉 NF1 미세 결손이 있는 환자의 경우 심지어 두 배나 높습니다. MPNST는 종양의 수가 많고 이러한 환자에서 흔히 볼 수 있는 위치가 다양하기 때문에 초기 단계에서 진단하기 어렵습니다. 이 종양은 주변 조직에 쉽게 침투하고 종종 전이를 일으킵니다. 현재 유일한 치료법은 이러한 MPNST를 외과적으로 제거하는 것입니다. 종양의 크기와 중요한 신경의 위치, 진단 시 종양이 이미 전이된 경우가 많기 때문에 완전한 절제가 어려운 경우가 많습니다. MPNST 환자의 5년 생존율은 25% 미만입니다. MPNST의 경우 다른 암과 마찬가지로 진단 당시 질병의 범위와 확산이 치료 결과를 결정하는 중요한 요소입니다. 이와 관련하여 종양을 선별하기 위해 종양 마커가 개발되었지만 암의 일부만이 마커로 사용할 수 있는 특정 단백질을 분비합니다. 순환 핵산과 같은 새로운 마커에 대한 관심이 증가했습니다. 건강하고 질병에 걸린 개인의 혈장, 혈청 및 기타 체액에서 무세포 순환 핵산의 검출은 MPNST가 있는 NF1 환자에게도 적용할 수 있는 질병을 진단하고 모니터링할 수 있는 가능성을 열었습니다. 건강한 사람과 아픈 사람의 혈액에서 세포외 순환 핵산의 존재는 1948년 Mandel과 Métais에 의해 처음으로 기술되었습니다. 1977년 Leon 그룹은 처음으로 혈청에서 무세포 DNA를 정량화했습니다. 그들은 암 환자가 건강한 대조군에 비해 순환하는 DNA 수치가 높은 경향이 있고, 국소 질환에 비해 전이 환자에서 DNA 양이 훨씬 더 많다는 것을 발견했지만 DNA의 기원에 대해서는 알려진 바가 없었습니다. 암 환자의 혈장과 혈청에서 종양 관련 미소부수체 변이의 존재가 보고되면서 혈장/혈청 DNA 연구에서 상당한 진전이 이루어졌습니다. 이러한 발견에 따르면 순환하는 DNA가 악성 종양의 진단 및 예후에 대한 잠재력을 가질 수 있음이 시사되었습니다. 여전히 DNA 방출 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았으며 다른 가설이 제안되었습니다. 순환 DNA가 종양 세포의 괴사 또는 세포 사멸로 인한 DNA 누출에서 유래한다는 첫 번째 가설은 방사선 치료 후 DNA 수준이 감소했다는보고로 논란이되었습니다. 미세전이에 대한 또 다른 가설은 혈장 내 세포 수가 순환하는 DNA의 양과 일치하지 않기 때문에 기각되었습니다. 세 번째 가설은 세포 증식에 ​​의한 혈액 내 종양 DNA의 자발적이고 활동적인 방출입니다. 그러나 후자의 메커니즘에 대한 설득력 있는 설명은 없습니다.

연구 프로토콜 연구의 첫 번째 부분은 혈장에서 DNA 추출 기술을 최적화하는 것입니다. 문헌에 기술된 다양한 DNA 추출 방법은 교수 Dr. Patrick Schöffski(UZLeuven)와 협력하여 수집된 샘플에 대해 테스트됩니다. 일상적인 검사를 위해 암 환자에게서 혈액을 채취할 때 추가로 5mL(EDTA 튜브)를 실험에 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플은 샘플링 후 몇 시간 이내에 수집되고 우리 연구실(신경섬유종증 연구를 위한 연구실)에서 24시간 이내에 처리됩니다. 혈액 샘플은 10분 동안 1600rpm에서 원심분리됩니다. 버피 코트를 방해하지 않고 상청액 플라즈마를 수집하고 입자를 제거하기 위해 10분 동안 13000rpm에서 재원심분리합니다. 상청액 혈장은 0.5mL 부피로 분주됩니다. 샘플은 추가 사용 전까지 -80°C에서 보관됩니다. 문헌에 따르면 환자마다 페놀-클로로포름 추출 및 상업용 키트와 같은 다른 방법을 사용하여 다른 분취량을 추출합니다. 게놈 참조 DNA는 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 버피 코트에서 추출됩니다. DNA 추출의 종류에 따라 DNA의 양과 질의 차이를 예상합니다. MPNST가 있는 NF1 환자의 혈장에서 DNA를 추출하기 위해 가장 높은 수율과 최고의 DNA 품질을 가진 방법이 선택됩니다.

이 작업의 두 번째 부분은 플라즈마 DNA를 사용한 마이크로어레이 실험의 최적화가 될 것입니다. MPNST가 있는 NF1 환자의 혈장 샘플은 독일 Eppendorf 대학의 Victor Mautner 그룹과 협력하여 수집됩니다. 혈액 샘플의 직접 처리는 독일에서 이루어지며 냉동 버피 코트와 혈장 부분 표본은 암호화된 방식으로 루벤으로 보내질 것입니다. 버피 코트와 혈장과 함께 환자 MPNST의 냉동 조직도 보내질 것입니다. 종양의 DNA는 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 추출됩니다. 마이크로어레이 CGH는 복제수 변경 목록에서 복제수 가변 영역을 제외하기 위해 기준으로 버피 코트 DNA가 있는 종양 및 혈장 DNA 모두에서 수행됩니다. 혈장 DNA의 어레이 프로필은 종양 관련 복제 수 변화에 대해 확인됩니다. 그런 식으로, 어레이 프로토콜은 혈장으로부터 무세포 DNA의 종양 특이적 카피 수 이상을 검출하기 위해 더욱 최적화될 수 있습니다.

본 연구는 '의생명과학 박사' 및 '의생명 석사' 학위 취득의 일환으로 신경섬유종증 연구실 박사과정 학생인 Eline Bert와 신경섬유종증 연구실 석사논문생인 Radost Ratcheva가 수행한 연구입니다. Sciences'에서 각각 Dr. Eric Legius 교수가 프로모터 및 주요 연구원으로 참여했습니다. Katholieke Universiteit Leuven 및 UZ Leuven만이 이 연구에 참여하지 않습니다. 설명된 실험에서 얻은 결과는 순수한 과학적 정보로 간주되어야 하며 그 어떤 것도 환자에게 보고되지 않습니다.

UZLeuven 암 환자의 혈액 샘플은 DNA 추출 절차를 최적화하는 데만 사용되며, 추출된 DNA는 정량화되지만 더 이상 분석되지 않으며 나중에 폐기됩니다.