NF1 MPNSTs 患者循环肿瘤血浆 DNA 的微阵列 CGH 分析

简介 1 型神经纤维瘤病 (NF1) 是一种常染色体显性遗传病，每 3500 名活新生儿中就有 1 人发病。 该病是由位于染色体 17q11.2 上的 NF1 基因的杂合突变引起的。 NF1 基因编码肿瘤抑制因子神经纤维瘤蛋白，它是 RAS 致癌基因的负调节因子。 临床上，NF1 患者有咖啡牛奶斑、雀斑、Lisch 结节和神经纤维瘤。 认知问题、骨病变和视神经胶质瘤在这些患者中也很常见。

神经纤维瘤是周围神经鞘的良性肿瘤，可出现在NF1患者身体的任何部位。 神经纤维瘤由不同的细胞类型组成，如雪旺细胞、成纤维细胞、肥大细胞和神经周围细胞。 如果在 NF1 患者的雪旺细胞中，野生型 NF1 等位基因失活，就会形成神经纤维瘤。 神经纤维瘤有 3 种类型：皮肤型、皮下型和丛状型。 皮肤神经纤维瘤在青春期分别表现为皮肤内或皮肤下的孤立结节。 丛状神经纤维瘤是先天性的，可以沿着周围神经的一大段扩散。 皮下神经纤维瘤是位于周围神经上的离散结节，其起源时间未知，但它们也可能起源于产前。

每个 NF1 患者一生中有 8% 到 13% 的风险发展为恶性周围神经鞘瘤 (MPNST)。 对于 NF1 患者亚群，即具有 NF1 微缺失的患者，这种风险甚至高出一倍。 MPNSTs 很难在早期诊断，因为这些患者经常看到大量的肿瘤和不同的位置。 这些肿瘤很容易浸润到周围组织中，并经常引起转移。 目前，唯一可用的治疗方法是手术切除这些 MPNST。 由于肿瘤的大小和重要神经的位置以及肿瘤在诊断时经常已经转移的事实，完全切除通常是困难的。 MPNSTs 患者的五年生存率低于 25%。 对于 MPNST，与其他癌症一样，诊断时疾病的范围和扩散是决定治疗结果的重要因素。 在这方面，已经开发了肿瘤标志物来筛选肿瘤，但只有一部分癌症会分泌可用作标志物的特定蛋白质。 人们对循环核酸等新标记的兴趣越来越大。 在健康和患病个体的血浆、血清和其他体液中检测游离细胞循环核酸，为诊断和监测疾病开辟了可能性，这也可能适用于 NF1 伴 MPNST 患者。 1948 年，Mandel 和 Métais 首次描述了健康人和病人血液中细胞外循环核酸的存在。 1977 年，Leon 小组首先对血清中的游离 DNA 进行了定量。 他们发现，与健康对照个体相比，癌症患者的循环 DNA 水平往往升高，而与局部疾病相比，转移患者的 DNA 数量甚至更多，但对 DNA 的来源一无所知。 当据报道癌症患者的血浆和血清中存在与肿瘤相关的微卫星改变时，血浆/血清 DNA 研究取得了重大进展。 根据这些发现，已经表明循环 DNA 可能具有诊断和预后恶性肿瘤的潜力。 尽管如此，DNA 释放的机制仍未完全阐明，并提出了不同的假设。 循环 DNA 起源于肿瘤细胞坏死或凋亡引起的 DNA 泄漏的第一个假设在据报道放疗后 DNA 水平下降时引起了争议。 另一个关于微转移的假设也被拒绝了，因为血浆中的细胞数量与循环 DNA 的数量不匹配。 第三个假设是增殖细胞在血液中自发和主动释放肿瘤 DNA。 然而，对于后一种机制没有令人信服的解释。

研究方案 研究的第一部分是优化从血浆中提取 DNA 的技术。 文献中描述的不同 DNA 提取方法将在与 Patrick Schöffski 教授（UZLeuven）合作收集的样本上进行测试。 当从癌症患者身上抽取血液进行常规检测时，额外的 5 mL（在 EDTA 管中）将可用于我们的实验。 血液样本将在采样后几小时内收集，并在我们的实验室（神经纤维瘤病研究实验室）24 小时内进行处理。 血液样本将以 1600 rpm 的转速离心 10 分钟。 在不干扰血沉棕黄层的情况下收集上清液血浆，并在 13000 rpm 下重新离心 10 分钟以去除颗粒。 上清血浆将被等分到 0.5 mL 体积。 样品将储存在 -80°C 直至进一步使用。 根据文献，每位患者将使用不同的方法提取不同的等分试样，如苯酚-氯仿提取和商业试剂盒。 将使用苯酚-氯仿提取法从血沉棕黄层中提取基因组参考 DNA。 根据 DNA 提取的类型，我们预计 DNA 的数量和质量会有所不同。 将选择具有最高产量和最佳 DNA 质量的方法从 NF1 MPNST 患者的血浆中提取 DNA。

这项工作的第二部分将是优化使用血浆 DNA 的微阵列实验。 来自 MPNSTs 的 NF1 患者的血浆样本将与德国 Eppendorf 大学的 Victor Mautner 小组合作收集。 血液样本的直接处理将在德国完成，冷冻血沉棕黄层和血浆等分试样将以编码方式发送到鲁汶。 与血沉棕黄层和血浆一起，患者的冷冻组织 MPNST 也将被发送。 使用苯酚-氯仿抽提法从肿瘤中提取 DNA。 将对肿瘤和血浆 DNA 进行微阵列 CGH，以血沉棕黄层 DNA 作为参考，以从拷贝数变化列表中排除拷贝数可变区域。 将检查血浆 DNA 的阵列概况以了解与肿瘤相关的拷贝数变化。 这样，可以进一步优化阵列协议，以检测血浆中无细胞 DNA 中的肿瘤特异性拷贝数异常。

这项研究由神经纤维瘤研究实验室的博士生 Eline Beert 和神经纤维瘤研究实验室的硕士论文学生 Radost Ratcheva 进行，作为获得“生物医学科学博士”和“生物医学硕士”学位的一部分Sciences'，分别由 Eric Legius 教授和主要研究人员担任。 只有 Katholieke Universiteit Leuven 和 UZ Leuven，但没有商业合作伙伴（如公司）将参与这项研究。 从所描述的实验中获得的结果必须被视为纯科学信息，不会向患者报告任何结果。

UZLeuven 癌症患者的血液样本将仅用于优化 DNA 提取程序，提取的 DNA 将被量化，但不会进一步分析，随后将被销毁。