Análisis de CGH de micromatrices de ADN plasmático tumoral circulante en pacientes con NF1 y MPNST

Introducción La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es un trastorno autosómico dominante que ocurre en 1 de cada 3500 recién nacidos vivos. La enfermedad está causada por mutaciones heterocigóticas del gen NF1, ubicado en el cromosoma 17q11.2. El gen NF1 codifica el supresor de tumores neurofibromina, un regulador negativo del oncogén RAS. Clínicamente, los pacientes con NF1 tienen máculas café con leche, pecas, nódulos de Lisch y neurofibromas. Los problemas cognitivos, las lesiones óseas y los gliomas de la vía óptica también son comunes en estos pacientes.

Los neurofibromas son neoplasias benignas de la vaina del nervio periférico, que pueden aparecer en cualquier parte del cuerpo de los pacientes con NF1. Los neurofibromas están compuestos por diferentes tipos de células, como las células de Schwann, los fibroblastos, los mastocitos y las células perineurales. Si en las células de Schwann de pacientes con NF1 se inactiva el alelo NF1 de tipo salvaje, se formará un neurofibroma. Hay 3 tipos de neurofibromas: cutáneos, subcutáneos y plexiformes. Los neurofibromas cutáneos aparecen durante la adolescencia como nódulos aislados en o debajo de la piel, respectivamente. Los neurofibromas plexiformes son congénitos y pueden diseminarse a lo largo de un gran segmento de un nervio periférico. Los neurofibromas subcutáneos son nódulos discretos ubicados en los nervios periféricos y se desconoce el momento de su origen, pero probablemente también sean de origen prenatal.

Todos los pacientes con NF1 tienen un riesgo de por vida de 8 a 13 % de desarrollar un tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST, por sus siglas en inglés). Este riesgo es incluso el doble para una subpoblación de pacientes con NF1, es decir, pacientes con una microdeleción de NF1. Los MPNST son difíciles de diagnosticar en la fase temprana debido a la gran cantidad de tumores y las diversas ubicaciones que a menudo se observan en estos pacientes. Estos tumores se infiltran fácilmente en el tejido circundante y con frecuencia dan lugar a metástasis. En este momento, el único tratamiento disponible es la extirpación quirúrgica de estos MPNST. La resección completa a menudo es difícil debido al tamaño de los tumores y la ubicación en nervios importantes y al hecho de que los tumores ya presentan metástasis en el momento del diagnóstico. La supervivencia a cinco años de los pacientes con MPNST es inferior al 25 %. Para los MPNST, como para otros tipos de cáncer, la extensión y la propagación de la enfermedad en el momento del diagnóstico es un factor importante para determinar el resultado del tratamiento. En este sentido, se han desarrollado marcadores tumorales para detectar tumores, pero solo un subconjunto de cánceres secreta proteínas específicas que pueden usarse como marcador. Creció un interés creciente en nuevos marcadores como los ácidos nucleicos circulantes. La detección de ácidos nucleicos circulantes libres de células en plasma, suero y otros fluidos corporales de individuos sanos y enfermos abrió la posibilidad de diagnosticar y monitorear la enfermedad, que también podría ser aplicable a pacientes con NF1 con MPNST. La presencia de ácidos nucleicos circulantes extracelulares en la sangre de personas sanas y enfermas fue descrita por primera vez por Mandel y Métais en 1948. En 1977 el grupo de León fue el primero en cuantificar ADN libre de células en suero. Descubrieron que los pacientes con cáncer tendían a tener niveles elevados de ADN circulante en comparación con los individuos de control sanos, y que la cantidad de ADN era aún mayor en pacientes con metástasis en comparación con la enfermedad localizada, pero no se sabía nada sobre el origen del ADN. Se logró un progreso significativo en la investigación del ADN en plasma/suero, cuando se informó la presencia de alteraciones de microsatélites asociadas a tumores en el plasma y suero de pacientes con cáncer. De acuerdo con estos hallazgos, se ha sugerido que el ADN circulante podría tener potencial para el diagnóstico y pronóstico de tumores malignos. Aún así, el mecanismo de liberación de ADN no está completamente aclarado y se han sugerido diferentes hipótesis. Una primera hipótesis de que el ADN circulante se origina a partir de la fuga de ADN debido a la necrosis o apoptosis de las células tumorales, se volvió controvertida cuando se informó que el nivel de ADN disminuyó después de la radioterapia. También se rechazó otra hipótesis sobre las micrometástasis porque la cantidad de células en el plasma no coincidía con la cantidad de ADN circulante. Una tercera hipótesis es la liberación espontánea y activa de ADN tumoral en la sangre por células en proliferación. Sin embargo, no hay una explicación convincente para este último mecanismo.

Protocolo de investigación Una primera parte del estudio será la optimización de la técnica de extracción de ADN del plasma. Se probarán diferentes métodos de extracción de ADN descritos en la literatura en muestras recolectadas en cooperación con el Prof. Dr. Patrick Schöffski (UZLeuven). Cuando se extrae sangre de pacientes con cáncer para pruebas de rutina, estarán disponibles 5 ml adicionales (en tubo con EDTA) para nuestros experimentos. Las muestras de sangre se recolectarán unas pocas horas después del muestreo y se procesarán dentro de las 24 horas en nuestro laboratorio (laboratorio para la investigación de neurofibromatosis). Las muestras de sangre se centrifugarán a 1600 rpm durante 10 minutos. El plasma sobrenadante se recogerá, sin perturbar la capa leucocitaria, y se volverá a centrifugar a 13000 rpm durante 10 minutos para eliminar las partículas. El plasma sobrenadante se dividirá en alícuotas en volúmenes de 0,5 ml. Las muestras se almacenarán a -80°C hasta su uso posterior. Por paciente, se extraerán diferentes alícuotas utilizando diferentes métodos, como la extracción con fenol-cloroformo y kits comerciales, según la literatura. El ADN genómico de referencia se extraerá de la capa leucocitaria mediante extracción con fenol-cloroformo. Dependiendo del tipo de extracción de ADN, esperamos diferencias en la cantidad y calidad del ADN. Se elegirá el método con el mayor rendimiento y la mejor calidad de ADN para extraer ADN del plasma de pacientes con NF1 con MPNST.

La segunda parte de este trabajo será la optimización del experimento de microarrays utilizando ADN plasmático. Las muestras de plasma de pacientes con NF1 con MPNST se recolectarán en colaboración con el grupo de Victor Mautner de la Universidad de Eppendorf en Alemania. El procesamiento directo de las muestras de sangre se realizará en Alemania y las capas leucocitarias congeladas y las alícuotas de plasma se enviarán a Lovaina de forma codificada. Junto con las capas leucocitarias y el plasma, también se enviará tejido congelado de los pacientes MPNST. El ADN del tumor se extraerá mediante extracción con fenol-cloroformo. Microarray CGH se realizará tanto en el tumor como en el ADN plasmático con el ADN de la capa leucocitaria como referencia para excluir las regiones variables del número de copias de la lista de cambios en el número de copias. Se comprobarán los perfiles de matriz del ADN plasmático en busca de cambios en el número de copias relacionados con el tumor. De esa manera, el protocolo de matriz se puede optimizar aún más para detectar anomalías en el número de copias específicas del tumor en el ADN libre de células del plasma.

Este estudio es realizado por Eline Beert, estudiante de doctorado en el laboratorio de investigación de neurofibromatosis, y Radost Ratcheva, estudiante de tesis de maestría en el laboratorio de investigación de neurofibromatosis, como parte de la obtención del título de 'Doctor en Ciencias Biomédicas' y 'Máster en Ciencias Biomédicas'. Sciences', respectivamente, con el Prof. Dr. Eric Legius como promotor e investigador principal. Solo la Katholieke Universiteit Leuven y la UZ Leuven, pero ningún socio comercial (como empresas) participará en este estudio. Los resultados obtenidos de los experimentos descritos deben considerarse información científica pura y no se informará a los pacientes.

Las muestras de sangre de los pacientes con cáncer de UZLeuven solo se utilizarán para optimizar el procedimiento de extracción de ADN, el ADN extraído se cuantificará pero no se analizará más y se destruirá posteriormente.