인간 상악동 Shneiderian 막의 골 형성 잠재력 (HMSSM)

1. hMSM 유래 세포의 분리 및 배양.

   조직은 항생제와 항진균제가 포함된 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 다시 세척하고 무균 상태에서 작은 조각으로 절단한 후 0.06% 콜라게나제 II형(In vitrogen)과 디스파제로 처리하고 인큐베이터(CO2 인큐베이터, Forma Scientific) 37°C에서 4시간 동안 5% CO2를 함유하고, 1,000(Revolution Per Minute)에서 10분간 원심분리(대용량 탁상형 원심분리기).

   • 침전물을 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 함유된 alpha minimum essential medium(α-MEM)(Sigma-Aldrich)에 현탁하고 40μm cell strainer(BD Bioscience)로 여과하여 모든 조직을 hMSSM 유래 세포를 제외하고는 필터링되었습니다.
   • 걸러낸 용액을 인큐베이터에서 배양하였다. 도립현미경으로 매일의 형태학적 특징을 관찰하고 배양액을 격일로 교체한다. 배지를 교체할 때 배양판에 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 세포만 배양합니다. 배양 접시가 거의 포화 상태가 되면 세포를 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 분리한 다음 계속 통과시키기 위해 반복합니다. 세포는 골 형성 가능성에 대해 계대 3에서 분석됩니다.

2. 유세포분석. osteoprogenitor 세포 마커의 발현에 대한 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석은 비골형성 배지에서 배양된 1차 세포(P0), 계대 1(P1) 배양 및 계대 2(P2) 배양의 샘플에서 수행되었습니다.

   hMSM에서 MPC(Mesenchymal progenitor cell)를 분리하기 위한 세포 표면 마커 STRO-1, CD105 및 CD146에 대한 유세포 분석이 수행됩니다. 계대 3의 hMSSM 유래 세포를 시험관(Becton-Dickinson)에 1 x104 세포/mL씩 넣고 세척 완충액(0.2% 소혈청 알부민, 0.1% 아지드화나트륨, 0.5mmol/L EDTA)으로 3회 세척합니다. ). fluorescein isothiocyanate와 phycoerythrin이 부착된 CD146(BD Bioscience)과 CD105(BD Bioscience)의 항체를 1시간 동안 처리하고 wash buffer로 3번 세척한 후 flow cytometry(BD bioscience)로 줄기세포의 기원을 관찰하였다. ). STRO-1(human antimouse monoclonal antibody, immunoglobulin M subclass; R&D Systems)의 경우 항체를 1시간 동안 처리하고 세척 완충액으로 3회 세척한 후 fluorescein isothiocyanate가 부착된 2차 항체를 30분간 처리하고, 세척 완충액으로 3회 세척하고 유세포분석기로 관찰하였다.

3. hMSM의 골형성 분화

   계대 3의 hMSM 유래 세포를 12웰 플레이트에서 1 내지 4주 동안 골형성 배지에서 웰당 105개 세포의 밀도로 배양하고 두 그룹으로 나누었다. 대조군은 정상배지(완전 α-MEM)에, 실험군은 골분화배지(0.1μm dexamethasone, 10μm glycerol phosphate, 50μm L-ascorbic acid 2-phosphate를 포함하는 α-MEM)에 재접종하였다. ). 배지는 3일마다 교체되었습니다.

   3.1- 알칼리성 포스파타제 및 알리자린 레드 염색. 대조구와 실험배양물은 처리일로부터 7, 14, 21, 28일째 멸균 삼중 증류수로 각각 3회 세척하고, 시트레이트-아세톤-포름알데히드 고정액(Sigma)으로 고정하고, 다시 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 삼중 증류수. 그런 다음 알칼리성 염료 혼합물(아질산염, Fast Red Violet-알칼리성, 나프톨 알칼리성 용액; Sigma)로 염색하고 상온에서 15분 동안 어두운 곳에서 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하고 헤마톡실린(Sigma)으로 대조 염색했습니다. ), 다시 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하고 도립현미경으로 관찰하였다.

   알리자린 레드 염색. 대조군과 실험군 시료는 처리일로부터 7일, 14일, 21일, 28일에 멸균 삼중 증류수로 각각 3회 세척하고, 4% 파라포름알데히드(Merck)로 15분간 고정하고, 30분간 빛을 차단하면서 염색하였다. 2% alizarin red solution(Sigma)로 1분, 다시 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하고 도립현미경으로 염색을 관찰한다.

   3.2- 폰 코사 염색. 대조군과 실험 배양액을 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하고 상온에서 4% 파라포름알데히드(Merck)로 15분간 고정한 후 다시 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하였다. 1% 질산은(Merck) 용액으로 빛을 분리하면서 30분 동안 염색한 후 멸균 삼중 증류수로 3회 세척하고 자외선 아래에서 1시간 동안 방치한 후 0.1% 에오신(Sigma)으로 대조염색한 후 염색하였다. 도립현미경으로 관찰하게 됩니다.

   3.3- 정량적 PCR(qPCR). 오스테오칼신 발현을 관찰하기 위해 두 그룹으로 분화된 hMSM 유래 세포를 골형성 분화 배지에 처리한 후 7일, 14일, 21일, 28일에 (PBS)로 세척하고 세포 스크레이퍼로 수집하였다. 리보핵산(RNA)을 RNA 추출키트로 분리한 후 분리된 RNA, 오스테오칼신 또는 골시알로프로테인 또는 상아질기질단백질 1 프라이머 및 프로브와 역전사 중합효소 연쇄반응 프리믹스로 역전사 반응을 진행합니다. (응용 바이오시스템즈). 얻은 데이터는 18 Shake를 사용하여 정규화됩니다. 증폭된 산물은 딜-델타 컴퓨터 단층촬영 분석을 사용하여 분석되었습니다.

4. 부비동 점막의 동결 절편에서 알칼리성 포스파타제 활성의 조직화학적 염색.

   신선하게 준비한 부비동 점막을 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고, 약 5x5mm의 조각으로 절단하고, 최적 절단 온도 조직 화합물(OCT 화합물; Miles Laboratories, USA)에 포매하고 -80℃에서 보관하였다. 냉동 절편 폴리-D-라이신 코팅된 슬라이드에 장착된 (7mm)를 얼음처럼 차가운 아세톤으로 1분 동안 고정하고 공기 건조시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후 0.15 ml의 N,NO-디메틸-포름아미드에 4 mg의 나프톨 포스페이트 및 12 mg의 패스트 블루 염(Sigma, St Louis, USA)을 함유하는 알칼리 포스파타제 활성 기질 용액과 함께 15℃에서 인큐베이션하였다. 트리스-염화수소(pH 9.6) ml. 증류수로 헹군 후 슬라이드를 헤마톡실린-에오신으로 역염색하고 수용성 레진에 묻혀 사진을 찍었다.

5. 점막의 동결 절편에서 STRO-1 양성 세포의 면역조직화학적 결정.

냉동 절편(7mm)을 차가운 아세톤으로 1분 동안 고정하고 PBS로 세척했습니다. 슬라이드를 0.3% 과산화수소가 포함된 PBS에 15분 동안 넣어 내인성 퍼옥시다제를 켄칭하고 세척한 후 실온에서 1시간 동안 PBS 내 2% 소 혈청 알부민으로 차단했습니다. 절편을 차단 용액에서 STRO-1 항체(마우스 단클론 항체, IgM 서브클래스; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA)의 1:50 희석액과 함께 41℃에서 밤새 배양했습니다. 양성 세포, 슬라이드를 비오티닐화된 염소 항-마우스 면역 글로불린 M(IgM)(1:100, 오스트리아 비엔나 소재 안 데르 그럽) 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체(BioFX Laboratories, Inc., MD, USA)와 각각 인큐베이션하였다. 실온에서 45분 동안. 과산화효소 함유 복합체를 디아미노벤지딘 기질(Dako, Glostrup, Denmark)로 시각화하고 헤마톡실린으로 대비염색했습니다. 섹션은 수용성 수지에 묻혀 사진을 찍었습니다.