Det osteogene potensialet til menneskelig maksillær sinus Shneiderian membran (HMSSM)

1. Isolering og kultur av hMSM-avledede celler.

   Vevet vil bli vasket igjen med fosfatbufret saltvann (PBS) som inkluderte antibiotika og antimytotisk, kuttet i små biter under aseptiske forhold, behandlet med 0,06 % kollagenase type II (in vitrogen) og dispase, ristet med en inkubator (CO2-inkubator, Forma) Scientific) som inneholder 5 % CO2 ved 37°C i 4 timer, og sentrifugert ved 1000 (omdreininger per minutt) i 10 minutter (bordsentrifuge med stor kapasitet).

   • Bunnfallet ble suspendert i et alfa-minimum essensielt medium (α-MEM) (Sigma-Aldrich) inneholdende 10 % føtalt bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin og filtrert med en 40-μm cellesil (BD Bioscience), som alt vev med bortsett fra at hMSSM-avledede celler ble filtrert ut.
   • Løsningen som ble filtrert ut ble dyrket i en inkubator. Daglige morfologiske egenskaper vil bli observert med et invertert mikroskop, og kulturløsningen vil bli endret annenhver dag. Når mediet skal endres, vil celler som ikke fester seg til kulturplaten bli fjernet, og bare de adherente cellene vil bli dyrket. Når kulturskålene blir nesten konfluente, vil cellene separeres med trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og deretter gjentas for fortsatt passasje. Cellene vil bli analysert ved passasje 3 for deres osteogene potensial.

2. Flowcytometri. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) analyse for ekspresjon av osteoprogenitorcellemarkører ble utført på prøver fra primære celler (P0), passasje 1 (P1) kulturer og passasje 2 (P2) kulturer dyrket i ikke-steogent medium.

   Flowcytometri på celleoverflatemarkørene STRO-1, CD105 og CD146 for separasjon av mesenkymale stamceller (MPC) fra hMSM vil bli utført. De hMSSM-avledede cellene ved passasje 3 vil bli plassert i et reagensrør (Becton-Dickinson) med 1 x 104 celler/ml og vasket tre ganger med vaskebuffer (0,2 % bovint serumalbumin, 0,1 % natriumazid, 0,5 mmol/L EDTA ). Antistoffene til CD146 (BD Bioscience) og CD105 (BD Bioscience) som fluorescein isothiocyanat og phycoerythrin ble festet til vil bli behandlet i 1 time og vasket med vaskebuffer tre ganger, og stamcellens opprinnelse ble observert med flowcytometri (BD bioscience) ). For STRO-1 (humant antimus monoklonalt antistoff, immunglobulin M underklasse; R&D Systems) ble antistoff behandlet i 1 time og vasket tre ganger med vaskebuffer, og det sekundære antistoffet, som fluorescein isotiocyanat var festet til, ble behandlet i 30 minutter, vasket tre ganger med vaskebuffer, og observert med flowcytometri.

3. Osteogen differensiering av hMSM

   De hMSM-avledede cellene ved passasje 3 ble inkubert i osteogent medium i 1 til 4 uker i 12-brønnsplater med en tetthet på 105 celler per brønn og delt i to grupper. Kontrollgruppen ble utplatet på nytt i et normalt medium (komplett α-MEM), og den eksperimentelle gruppen ble utplatet på nytt i osteogent differensieringsmedium (α-MEM inkludert 0,1 μm deksametason, 10 μm glyserolfosfat og 50 μm L-askorbinsyre 2-fosfat ). Media ble skiftet hver 3. dag.

   3.1- Alkalisk fosfatase og Alizarin rød farging. Kontroll- og eksperimentelle kulturer ble hver vasket tre ganger med sterilt trippel-destillert vann 7, 14, 21 og 28 dager etter behandlingsdatoen, fiksert med sitrat-aceton-formaldehyd-fikseringsløsning (Sigma), og vasket igjen tre ganger med sterilt. trippel-destillert vann. De ble deretter farget med en alkalisk fargeblanding (nitritt, rask rød fiolett-alkalisk, naftol alkalisk løsning; Sigma), i mørket i 15 minutter ved normal temperatur, vasket tre ganger med sterilt trippel-destillert vann, motfarget med hematoksylin (Sigma) ), vasket igjen tre ganger med sterilt trippel-destillert vann og observert med et omvendt mikroskop.

   Alizarin rødfarging. Kontroll- og eksperimentelle gruppeprøver ble hver vasket tre ganger med sterilt trippel-destillert vann 7, 14, 21 og 28 dager fra behandlingsdatoen, fiksert med 4 % paraformaldehyd (Merck) i 15 minutter, farget mens lyset ble isolert i 30 minutter. minutter med 2 % alizarinrød løsning (Sigma), vasket igjen tre ganger med sterilt trippeldestillert vann, og fargingen vil bli observert med et invertert mikroskop.

   3.2- Von Kossa-farging. Kontroll- og eksperimentelle kulturer ble vasket tre ganger med sterilt trippel-destillert vann, fiksert med 4% paraformaldehyd (Merck) ved normal temperatur i 15 minutter og vasket igjen tre ganger med sterilt trippel-destillert vann. De ble farget i 30 minutter mens lys ble isolert med 1 % sølvnitrat (Merck) løsning, vasket tre ganger med sterilt trippel-destillert vann, hensatt under ultrafiolett lys i 1 time, motfarget med 0,1 % eosin (Sigma) og fargingen vil bli observert med et omvendt mikroskop.

   3.3- Kvantitativ PCR (qPCR). For å observere osteokalsinekspresjon ble de hMSM-avledede cellene, differensiert i to grupper, vasket med (PBS) 7, 14, 21 og 28 dager etter behandling i osteogent differensieringsmedium og samlet med en celleskraper. Etter at ribonukleinsyren (RNA) ble separert med et RNA-ekstraksjonssett, gjennomgikk den en revers-transkripsjonsreaksjon med det separerte RNA-, osteokalsin- eller bensialoproteinet, eller dentinmatriseprotein 1-primere og prober, og revers-transkriptase-polymerase-kjedereaksjonsforblanding (Applied Biosystems). De oppnådde dataene vil bli normalisert med 18 Shake. De amplifiserte produktene ble analysert ved bruk av deal-delta Computer Tomography-analyse.

4. Histokjemisk farging av alkalisk fosfataseaktivitet i frosne deler av sinus slimhinne.

   Nypreparert sinus slimhinne ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS), kuttet i biter på ca. 5x5 mm, innebygd i vevsblanding med optimal kuttetemperatur (OCT-forbindelse; Miles Laboratories, USA), og lagret ved -80 C. Frosne seksjoner (7 mm) montert på poly-D-lysin-belagte objektglass ble fiksert med iskald aceton i 1 min og fikk lufttørke. Objektglassene ble vasket med PBS og deretter inkubert med substratløsningen for alkalisk fosfataseaktivitet inneholdende 4 mg naftolfosfat i 0,15 ml N, N0 -dimetylformamid og 12 mg raskt blått salt (Sigma, St Louis, USA) i 15 ml Tris-hydrogenklorid (pH 9,6). Etter skylling med destillert vann ble objektglass motfarget med hematoksylin-eosin, innebygd i vannløselig harpiks og fotografert.

5. Immunhistokjemisk bestemmelse av STRO-1-positive celler i frosne deler av slimhinnen.

Frosne seksjoner (7 mm) ble fiksert med kald aceton i 1 min og vasket i PBS. Objektglassene ble plassert i PBS inneholdende 0,3 % hydrogenperoksid i 15 minutter for å stoppe endogen peroksidase, vasket og blokkert med 2 % bovint serumalbumin i PBS i 1 time ved romtemperatur. Seksjoner ble inkubert med en 1:50 fortynning av STRO-1-antistoffet (monoklonalt museantistoff, IgM-underklasse; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) i blokkeringsløsning over natten ved 41 grader C. For påvisning av STRO-1- positive celler, ble objektglass inkubert med et biotinylert geit-anti-mus immunglobulin M (IgM) (1 : 100, An der Grub, Wien, Østerrike) og et streptavidin-peroksidase-konjugat (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) hver ved romtemperatur i 45 min. Det peroksidaseholdige komplekset ble visualisert med diaminobenzidinsubstrat (Dako, Glostrup, Danmark) og motfarget med hematoksylin. Seksjonene ble innebygd i vannløselig harpiks og fotografert.