Остеогенный потенциал шнейдериевой мембраны верхнечелюстной пазухи человека (HMSSM)

1. Выделение и культивирование клеток, происходящих из чМСМ.

   Ткань снова промывают фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим антибиотик и антимитотик, разрезают на мелкие кусочки в асептических условиях, обрабатывают 0,06% коллагеназой типа II (In vitrogen) и диспазом, встряхивают в инкубаторе (CO2-инкубатор, Forma Scientific), содержащие 5% CO2, при 37°C в течение 4 часов и центрифугировали при 1000 (оборотов в минуту) в течение 10 минут (настольная центрифуга большой емкости).

   • Осадок суспендировали в альфа-минимальной эссенциальной среде (α-MEM) (Sigma-Aldrich), содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки и 1 % пенициллин-стрептомицина, и фильтровали с помощью 40-мкм клеточного фильтра (BD Bioscience), с помощью которого все ткани за исключением клеток, полученных из hMSSM, отфильтровывали.
   • Отфильтрованный раствор культивировали в инкубаторе. Ежедневные морфологические характеристики будут наблюдаться с помощью инвертированного микроскопа, а культуральный раствор будет меняться через день. Когда среда будет изменена, клетки, не прилипшие к культуральному планшету, будут удалены, и будут культивироваться только прилипшие клетки. Когда чашки для культивирования станут почти сливными, клетки будут разделены трипсином-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и впоследствии повторены для дальнейшего пассирования. Клетки будут проанализированы на пассаже 3 на их остеогенный потенциал.

2. Проточной цитометрии. Анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) для экспрессии маркеров клеток-предшественников остеогенеза проводили на образцах из первичных клеток (P0), культур пассажа 1 (P1) и культур пассажа 2 (P2), культивируемых в неостеогенной среде.

   Будет проведена проточная цитометрия на маркерах клеточной поверхности STRO-1, CD105 и CD146 для отделения мезенхимальных клеток-предшественников (MPC) от hMSM. Клетки, полученные из hMSSM, при пассаже 3 будут помещены в пробирку (Becton-Dickinson) в количестве 1 x 104 клеток/мл и трижды промыты промывочным буфером (0,2% бычий сывороточный альбумин, 0,1% азид натрия, 0,5 ммоль/л ЭДТА). ). Антитела CD146 (BD Bioscience) и CD105 (BD Bioscience), к которым были присоединены изотиоцианат флуоресцеина и фикоэритрин, будут обрабатываться в течение 1 часа и трижды промываться промывочным буфером, а происхождение стволовых клеток будет наблюдаться с помощью проточной цитометрии (BD bioscience ). Для STRO-1 (человеческое антимышиное моноклональное антитело, подкласс иммуноглобулина М; R&D Systems) антитело обрабатывали в течение 1 часа и трижды промывали промывочным буфером, а вторичное антитело, к которому был присоединен изотиоцианат флуоресцеина, обрабатывали в течение 30 минут. промывали три раза промывочным буфером и наблюдали с помощью проточной цитометрии.

3. Остеогенная дифференциация чМСМ

   Клетки, полученные из чМСМ на 3-м пассаже, инкубировали в остеогенной среде от 1 до 4 недель в 12-луночных планшетах при плотности 105 клеток на лунку и разделяли на две группы. Контрольная группа была пересажена в нормальную среду (полная α-MEM), а экспериментальная группа была пересажена в среду для остеогенной дифференцировки (α-MEM, включающая 0,1 мкМ дексаметазона, 10 мкМ глицеринфосфата и 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата). ). Среду меняли каждые 3 дня.

   3.1- Щелочная фосфатаза и окрашивание ализариновым красным. Контрольную и опытную культуры трижды промывали стерильной тридистиллированной водой через 7, 14, 21 и 28 дней после обработки, фиксировали цитратно-ацетонформальдегидным фиксирующим раствором (Sigma) и повторно трижды промывали стерильной вода тройная дистилляция. Затем окрашивали смесью щелочных красителей (нитрит, устойчивый красный фиолетовый-щелочной, нафтоловый щелочной раствор; Sigma), в темноте в течение 15 минут при нормальной температуре, трижды промывали стерильной тридистиллированной водой, докрашивали гематоксилином (Sigma ), снова трижды промывали стерильной тридистиллированной водой и наблюдали в инвертированном микроскопе.

   Окрашивание ализариновым красным. Образцы контрольной и опытной групп трижды промывали стерильной тридистиллированной водой через 7, 14, 21 и 28 дней от даты обработки, фиксировали 4% параформальдегидом (Merck) в течение 15 минут, окрашивали при выделении света в течение 30 минут. минут 2% раствором ализаринового красного (Sigma), снова трижды промывают стерильной тридистиллированной водой и наблюдают окрашивание в инвертированном микроскопе.

   3.2- Окрашивание фон Косса. Контрольные и опытные культуры трижды промывали стерильной тридистиллированной водой, фиксировали 4%-ным параформальдегидом (Merck) при нормальной температуре в течение 15 минут и повторно трижды промывали стерильной тридистиллированной водой. Окрашивали в течение 30 мин при выделении света 1% раствором нитрата серебра (Merck), трижды промывали стерильной тридистиллированной водой, оставляли в ультрафиолетовом свете на 1 час, докрашивали 0,1% эозином (Sigma) и окрашивали будет наблюдаться в инвертированном микроскопе.

   3.3- Количественная ПЦР (кПЦР). Для наблюдения за экспрессией остеокальцина клетки, полученные из hMSM, дифференцированные на две группы, промывали (PBS) через 7, 14, 21 и 28 дней после обработки в среде для остеогенной дифференцировки и собирали клеточным скребком. После того как рибонуклеиновая кислота (РНК) была выделена с помощью набора для выделения РНК, она подвергалась реакции обратной транскрипции с выделенной РНК, остеокальцином или костным сиалопротеином, или праймерами и зондами белка матрикса 1 дентина, а также премиксом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой. (Прикладные биосистемы). Полученные данные будут нормализованы с помощью 18 Shake. Амплифицированные продукты анализировали с помощью анализа компьютерной томографии дело-дельта.

4. Гистохимическое окрашивание активности щелочной фосфатазы в замороженных срезах слизистой оболочки пазух.

   Свежеприготовленную слизистую оболочку придаточных пазух промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), разрезали на кусочки примерно 5x5 мм, заливали в тканевый компаунд с оптимальной температурой резания (компаунд ОСТ; Miles Laboratories, США) и хранили при -80°С. Замороженные срезы (7 мм) на предметных стеклах, покрытых поли-D-лизином, фиксировали ледяным ацетоном в течение 1 мин и давали высохнуть на воздухе. Предметные стекла промывали PBS и затем инкубировали с раствором субстрата для определения активности щелочной фосфатазы, содержащим 4 мг нафтолфосфата в 0,15 мл N,N0-диметилформамида и 12 мг соли прочного синего (Sigma, Сент-Луис, США) в течение 15 минут. мл трис-хлористого водорода (pH 9,6). После ополаскивания дистиллированной водой предметные стекла докрашивали гематоксилин-эозином, заливали в водорастворимую смолу и фотографировали.

5. Иммуногистохимическое определение STRO-1-позитивных клеток в замороженных срезах слизистой оболочки.

Замороженные срезы (7 мм) фиксировали холодным ацетоном в течение 1 мин и промывали в PBS. Предметные стекла помещали в PBS, содержащий 0,3% перекиси водорода, на 15 минут для подавления эндогенной пероксидазы, промывали и блокировали 2% бычьим сывороточным альбумином в PBS на 1 час при комнатной температуре. Срезы инкубировали с разведением 1:50 антитела STRO-1 (мышиное моноклональное антитело, подкласс IgM; Developmental Studies Hybridoma Bank, Университет Айовы, США) в блокирующем растворе в течение ночи при 41°С. Для выявления STRO-1- положительные клетки, предметные стекла инкубировали с биотинилированным козьим антимышиным иммуноглобулином M (IgM) (1:100, An der Grub, Вена, Австрия) и конъюгатом стрептавидин-пероксидазы (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) каждый. при комнатной температуре в течение 45 мин. Комплекс, содержащий пероксидазу, визуализировали с помощью диаминобензидинового субстрата (Dako, Glostrup, Дания) и докрашивали гематоксилином. Срезы заливали водорастворимой смолой и фотографировали.