Het osteogene potentieel van het menselijke maxillaire sinus Shneideriaanse membraan (HMSSM)

1. Isolatie en kweek van hMSM-afgeleide cellen.

   Het weefsel wordt opnieuw gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met antibiotica en antimytotica, in kleine stukjes gesneden onder aseptische omstandigheden, behandeld met 0,06% collagenase type II (In vitrogen) en dispase, geschud met een incubator (CO2-incubator, Forma Scientific) met 5% CO2 bij 37°C gedurende 4 uur en gecentrifugeerd bij 1000 (Revolution Per Minute) gedurende 10 minuten (tafelcentrifuge met grote capaciteit).

   • Het neerslag werd gesuspendeerd in een alfa minimaal essentieel medium (α-MEM) (Sigma-Aldrich) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine en gefiltreerd met een 40-μm celzeef (BD Bioscience), waarmee alle weefsels behalve dat de van hMSSM afgeleide cellen werden uitgefilterd.
   • De uitgefilterde oplossing werd gekweekt in een incubator. Dagelijkse morfologische kenmerken zullen worden waargenomen met een omgekeerde microscoop en de kweekoplossing zal om de dag worden vervangen. Wanneer het medium wordt vervangen, worden cellen die niet hechten aan de kweekplaat verwijderd en worden alleen de hechtende cellen gekweekt. Wanneer de kweekschalen bijna samenvloeien, worden de cellen gescheiden met trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en vervolgens herhaald voor voortgezette passage. De cellen zullen bij passage 3 worden getest op hun osteogene potentieel.

2. Flowcytometrie. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) analyse voor de expressie van osteoprogenitorcelmarkers werd uitgevoerd op monsters van primaire cellen (P0), passage 1 (P1) culturen en passage 2 (P2) culturen gekweekt in niet-osteogeen medium.

   Flowcytometrie op de celoppervlakmarkers STRO-1, CD105 en CD146 voor scheiding van mesenchymale voorlopercellen (MPC's) van hMSM zal worden uitgevoerd. De hMSSM-afgeleide cellen bij passage 3 worden in een reageerbuis (Becton-Dickinson) geplaatst met 1 x 104 cellen/ml en driemaal gewassen met wasbuffer (0,2% runderserumalbumine, 0,1% natriumazide, 0,5 mmol/L EDTA ). De antilichamen van CD146 (BD Bioscience) en CD105 (BD Bioscience) waaraan fluoresceïne-isothiocyanaat en fycoerythrine waren gehecht, worden gedurende 1 uur behandeld en driemaal gewassen met wasbuffer, en de oorsprong van stamcellen werd waargenomen met flowcytometrie (BD bioscience ). Voor STRO-1 (menselijk antimuis monoklonaal antilichaam, immunoglobuline M subklasse; R&D Systems), werd het antilichaam gedurende 1 uur behandeld en driemaal gewassen met wasbuffer, en het secundaire antilichaam, waaraan fluoresceïne-isothiocyanaat was gehecht, werd gedurende 30 minuten behandeld. driemaal gewassen met wasbuffer en geobserveerd met flowcytometrie.

3. Osteogene differentiatie van hMSM

   De van hMSM afgeleide cellen bij passage 3 werden gedurende 1 tot 4 weken in platen met 12 putjes in osteogene media geïncubeerd bij een dichtheid van 105 cellen per putje en in twee groepen verdeeld. De controlegroep werd opnieuw uitgeplaat in een normaal medium (volledig α-MEM) en de experimentele groep werd opnieuw uitgeplaat in osteogeen differentiatiemedium (α-MEM inclusief 0,1 μm dexamethason, 10 μm glycerolfosfaat en 50 μm L-ascorbinezuur 2-fosfaat ). De media werden om de 3 dagen vervangen.

   3.1- Alkalische fosfatase en Alizarine rode kleuring. Controlekweken en experimentele kweken werden elk drie keer gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water op 7, 14, 21 en 28 dagen na de behandelingsdatum, gefixeerd met citraat-aceton-formaldehyde fixatieoplossing (Sigma), en opnieuw drie keer gewassen met steriele drievoudig gedestilleerd water. Ze werden vervolgens gekleurd met een alkalisch kleurstofmengsel (nitriet, Fast Red Violet-alkalische, naftol-alkalische oplossing; Sigma), in het donker gedurende 15 minuten bij normale temperatuur, driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water, tegengekleurd met hematoxyline (Sigma ), opnieuw driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water en geobserveerd met een omgekeerde microscoop.

   Alizarine rode kleuring. Controlemonsters en monsters van de experimentele groep werden elk driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water op 7, 14, 21 en 28 dagen vanaf de behandelingsdatum, gefixeerd met 4% paraformaldehyde (Merck) gedurende 15 minuten, gekleurd terwijl licht gedurende 30 minuten werd geïsoleerd. minuten met 2% alizarineroodoplossing (Sigma), opnieuw driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water, en de kleuring zal worden waargenomen met een omgekeerde microscoop.

   3.2- Von Kossa-kleuring. Controlekweken en experimentele kweken werden driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water, gefixeerd met 4% paraformaldehyde (Merck) bij een normale temperatuur gedurende 15 minuten en opnieuw driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water. Ze werden 30 minuten gekleurd terwijl licht werd geïsoleerd met 1% zilvernitraat (Merck) oplossing, driemaal gewassen met steriel drievoudig gedestilleerd water, 1 uur onder ultraviolet licht gelaten, tegengekleurd met 0,1% eosine (Sigma), en de kleuring worden bekeken met een omgekeerde microscoop.

   3.3- Kwantitatieve PCR (qPCR). Om osteocalcine-expressie waar te nemen, werden de van hMSM afgeleide cellen, gedifferentieerd in twee groepen, gewassen met (PBS) op 7, 14, 21 en 28 dagen na behandeling in osteogeen differentiatiemedium en verzameld met een celschraper. Nadat het ribonucleïnezuur (RNA) was gescheiden met een RNA-extractiekit, onderging het een omgekeerde transcriptiereactie met het gescheiden RNA, osteocalcine of botsialoproteïne, of dentinematrixproteïne 1-primers en -sondes, en reverse-transcriptase-polymerasekettingreactiepremix (Toegepaste biosystemen). De verkregen gegevens worden genormaliseerd met behulp van 18 Shake. De geamplificeerde producten werden geanalyseerd met behulp van de deal-delta Computer Tomography-analyse.

4. Histochemische kleuring van alkalische fosfatase-activiteit in bevroren secties van sinusmucosa.

   Vers geprepareerd sinusslijmvlies werd gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), in stukken van ongeveer 5x 5 mm gesneden, ingebed in weefselverbinding met optimale snijtemperatuur (OCT-verbinding; Miles Laboratories, VS) en bewaard bij -80 C. Ingevroren coupes (7 mm) gemonteerd op met poly-D-lysine gecoate objectglaasjes werden gedurende 1 minuut met ijskoude aceton gefixeerd en aan de lucht gedroogd. De objectglaasjes werden gewassen met PBS en vervolgens geïncubeerd met de substraatoplossing voor alkalische fosfatase-activiteit die 4 mg naftolfosfaat in 0,15 ml N,N0-dimethylformamide en 12 mg fast blue salt (Sigma, St. Louis, VS) in 15 minuten bevatte. ml tris-waterstofchloride (pH 9,6). Na spoelen met gedestilleerd water werden de objectglaasjes tegengekleurd met hematoxyline-eosine, ingebed in in water oplosbare hars en gefotografeerd.

5. Immunohistochemische bepaling van STRO-1-positieve cellen in bevroren mucosacoupes.

Bevroren secties (7 mm) werden gedurende 1 minuut gefixeerd met koude aceton en gewassen in PBS. De objectglaasjes werden gedurende 15 minuten in PBS met 0,3% waterstofperoxide geplaatst om endogeen peroxidase te doven, gewassen en geblokkeerd met 2% runderserumalbumine in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Secties werden geïncubeerd met een 1:50 verdunning van het STRO-1-antilichaam (monoklonaal muizenantilichaam, IgM-subklasse; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, VS) in blokkerende oplossing overnacht bij 41 ° C. Voor detectie van STRO-1- positieve cellen, objectglaasjes werden geïncubeerd met een gebiotinyleerd geit-antimuis-immunoglobuline M (IgM) (1: 100, An der Grub, Wenen, Oostenrijk) en een streptavidine-peroxidase-conjugaat (BioFX Laboratories, Inc., MD, VS) elk bij kamertemperatuur gedurende 45 min. Het peroxidase-bevattende complex werd gevisualiseerd door Diaminobenzidine-substraat (Dako, Glostrup, Denemarken) en tegengekleurd met hematoxyline. De secties werden ingebed in in water oplosbare hars en gefotografeerd.