Potencjał osteogenny ludzkiej błony Shneiderian zatoki szczękowej (HMSSM)

1. Izolacja i hodowla komórek pochodzących z hMSM.

   Tkanka zostanie ponownie przemyta solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą antybiotyk i środek przeciwmitotyczny, pocięta na małe kawałki w warunkach aseptycznych, potraktowana 0,06% kolagenazą typu II (In vitrogen) i rozproszona, wytrząsana w inkubatorze (inkubator CO2, Forma Scientific) zawierające 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 4 godziny i wirowane z prędkością 1000 (obrotów na minutę) przez 10 minut (wirówka stołowa o dużej pojemności).

   • Osad zawieszono w minimalnej niezbędnej pożywce alfa (α-MEM) (Sigma-Aldrich) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny i przesączono przez filtr komórkowy 40 μm (BD Bioscience), za pomocą którego wszystkie tkanki z wyjątkiem komórek pochodzących z hMSSM odfiltrowano.
   • Odfiltrowany roztwór hodowano w inkubatorze. Codzienne cechy morfologiczne będą obserwowane pod mikroskopem odwróconym, a roztwór hodowlany będzie zmieniany co drugi dzień. Gdy pożywka zostanie zmieniona, komórki, które nie przylegają do płytki hodowlanej, zostaną usunięte i hodowane będą tylko komórki przylegające. Gdy szalki hodowlane staną się prawie konfluentne, komórki zostaną rozdzielone trypsyną z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), a następnie powtórzone w celu dalszego pasażowania. Komórki będą badane w pasażu 3 pod kątem ich potencjału osteogennego.

2. Cytometrii przepływowej. Analizę sortowania komórek aktywowaną fluorescencją (FACS) pod kątem ekspresji markerów komórek osteoprogenitorowych przeprowadzono na próbkach z komórek pierwotnych (P0), hodowli pasażu 1 (P1) i hodowli pasażu 2 (P2) hodowanych w pożywce niesteogennej.

   Przeprowadzona zostanie cytometria przepływowa na markerach powierzchniowych komórek STRO-1, CD105 i CD146 w celu oddzielenia mezenchymalnych komórek progenitorowych (MPC) od hMSM. Komórki pochodzące z hMSSM w pasażu 3 zostaną umieszczone w probówce testowej (Becton-Dickinson) w stężeniu 1 x 104 komórek/ml i przemyte trzykrotnie buforem do przemywania (0,2% albumina surowicy bydlęcej, 0,1% azydek sodu, 0,5 mmol/l EDTA ). Przeciwciała CD146 (BD Bioscience) i CD105 (BD Bioscience), do których przylegał izotiocyjanian fluoresceiny i fikoerytryna, będą traktowane przez 1 godzinę i przemywane trzykrotnie buforem do płukania, a pochodzenie komórek macierzystych będzie obserwowane za pomocą cytometrii przepływowej (BD Bioscience ). W przypadku STRO-1 (ludzkie antymysie przeciwciało monoklonalne, podklasa immunoglobulin M; R&D Systems) przeciwciało traktowano przez 1 godzinę i przemywano trzykrotnie buforem do przemywania, a przeciwciało drugorzędowe, do którego przyłączono izotiocyjanian fluoresceiny, traktowano przez 30 minut, przemyto trzykrotnie buforem do przemywania i obserwowano za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Osteogenne różnicowanie hMSM

   Komórki pochodzące z hMSM w pasażu 3 inkubowano w pożywce osteogennej przez 1 do 4 tygodni w 12-studzienkowych płytkach przy gęstości 105 komórek na studzienkę i podzielono na dwie grupy. Grupę kontrolną powtórzono w normalnej pożywce (pełna α-MEM), a grupę eksperymentalną powtórzono w pożywce do różnicowania osteogennego (α-MEM, w tym 0,1 μm deksametazonu, 10 μm fosforanu glicerolu i 50 μm 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego ). Media były zmieniane co 3 dni.

   3.1- Barwienie fosfatazą alkaliczną i czerwienią alizarynową. Kultury kontrolne i eksperymentalne przemyto trzykrotnie sterylną wodą potrójnie destylowaną po 7, 14, 21 i 28 dniach od daty zabiegu, utrwalono roztworem utrwalającym cytrynian-aceton-formaldehyd (Sigma) i ponownie przemyto trzykrotnie sterylnym woda trzykrotnie destylowana. Następnie barwiono je zasadową mieszaniną barwników (azotyn, Fast Red Violet-alkaliczny, alkaliczny roztwór naftolu; Sigma), w ciemności przez 15 minut w normalnej temperaturze, przemywano trzykrotnie sterylną potrójnie destylowaną wodą, barwiono kontrastowo hematoksyliną (Sigma ), przemyto ponownie trzykrotnie sterylną potrójnie destylowaną wodą i obserwowano pod odwróconym mikroskopem.

   Barwienie czerwienią alizaryną. Próbki z grupy kontrolnej i eksperymentalnej przemyto trzykrotnie sterylną wodą potrójnie destylowaną w 7, 14, 21 i 28 dniu od daty zabiegu, utrwalono 4% paraformaldehydem (Merck) przez 15 minut, wybarwiono podczas izolacji światła przez 30 minut 2% roztworem czerwieni alizarynowej (Sigma), przemywa się ponownie trzykrotnie sterylną potrójnie destylowaną wodą, a wybarwienie będzie obserwowane pod odwróconym mikroskopem.

   3.2- Barwienie Von Kossa. Kultury kontrolne i doświadczalne przemyto trzykrotnie sterylną wodą potrójnie destylowaną, utrwalono 4% paraformaldehydem (Merck) w normalnej temperaturze przez 15 minut i ponownie przemyto trzykrotnie sterylną wodą potrójnie destylowaną. Barwiono je przez 30 minut, podczas gdy światło izolowano 1% roztworem azotanu srebra (Merck), przemywano trzykrotnie sterylną wodą potrójnie destylowaną, pozostawiano pod światłem ultrafioletowym na 1 godzinę, barwiono kontrastowo 0,1% eozyną (Sigma), a barwienie będzie obserwowany pod mikroskopem odwróconym.

   3.3- Ilościowa PCR (qPCR). Aby obserwować ekspresję osteokalcyny, komórki pochodzące z hMSM, zróżnicowane na dwie grupy, przemyto (PBS) po 7, 14, 21 i 28 dniach po traktowaniu w pożywce do różnicowania osteogennego i zebrano za pomocą skrobaczki do komórek. Po oddzieleniu kwasu rybonukleinowego (RNA) za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA, poddano go reakcji odwrotnej transkrypcji z oddzielonym RNA, osteokalcyną lub sialoproteiną kości lub starterami i sondami białka macierzy zębiny oraz premiksem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (biosystemy stosowane). Uzyskane dane zostaną znormalizowane za pomocą 18 Shake. Zamplifikowane produkty analizowano przy użyciu analizy tomografii komputerowej deal-delta.

4. Barwienie histochemiczne aktywności fosfatazy alkalicznej w zamrożonych skrawkach błony śluzowej zatok.

   Świeżo przygotowaną błonę śluzową zatok przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pocięto na kawałki o wymiarach około 5 x 5 mm, zatopiono w mieszance tkankowej o optymalnej temperaturze cięcia (związek OCT; Miles Laboratories, USA) i przechowywano w temperaturze -80 C. Zamrożone skrawki (7 mm) zamontowane na szkiełkach pokrytych poli-D-lizyną utrwalono lodowatym acetonem przez 1 minutę i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Szkiełka przemyto PBS, a następnie inkubowano z roztworem substratu do oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej, zawierającym 4 mg fosforanu naftolu w 0,15 ml N,N0-dimetyloformamidu i 12 mg soli fast blue (Sigma, St Louis, USA) w 15 ml chlorowodorku Tris (pH 9,6). Po wypłukaniu wodą destylowaną szkiełka barwiono kontrastowo hematoksyliną-eozyną, zatopiono w żywicy rozpuszczalnej w wodzie i sfotografowano.

5. Immunohistochemiczne oznaczanie komórek STRO-1-dodatnich w zamrożonych skrawkach błony śluzowej.

Zamrożone skrawki (7 mm) utrwalano zimnym acetonem przez 1 minutę i przemywano PBS. Szkiełka umieszczono w PBS zawierającym 0,3% nadtlenku wodoru na 15 minut w celu wygaszenia endogennej peroksydazy, przemyto i zablokowano 2% albuminą surowicy bydlęcej w PBS na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki inkubowano z rozcieńczeniem 1:50 przeciwciała STRO-1 (mysie przeciwciało monoklonalne, podklasa IgM; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) w roztworze blokującym przez noc w 41 stopniach C. Do wykrywania STRO-1- komórki dodatnie, szkiełka inkubowano z biotynylowaną kozią anty-mysią immunoglobuliną M (IgM) (1 : 100, An der Grub, Wiedeń, Austria) i koniugatem streptawidyna-peroksydaza (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) w temperaturze pokojowej przez 45 min. Kompleks zawierający peroksydazę wizualizowano za pomocą substratu diaminobenzydyny (Dako, Glostrup, Dania) i barwiono kontrastowo hematoksyliną. Skrawki zatopiono w żywicy rozpuszczalnej w wodzie i sfotografowano.