Das osteogene Potenzial der menschlichen Kieferhöhlen-Shneiderian-Membran (HMSSM)

1. Isolierung und Kultur von hMSM-abgeleiteten Zellen.

   Das Gewebe wird erneut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Antibiotika und Antimytotika enthielt, gewaschen, unter aseptischen Bedingungen in kleine Stücke geschnitten, mit 0,06 % Kollagenase Typ II (in vitrogen) behandelt und dispase, mit einem Inkubator (CO2-Inkubator, Forma Scientific) mit 5 % CO2 bei 37 °C für 4 Stunden und 10 Minuten bei 1.000 (Umdrehungen pro Minute) zentrifugiert (Tischzentrifuge mit großer Kapazität).

   • Das Präzipitat wurde in einem essentiellen Alpha-Minimum-Medium (α-MEM) (Sigma-Aldrich), das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt, suspendiert und mit einem 40-μm-Zellsieb (BD Bioscience) filtriert, wodurch alle Gewebe entfernt wurden außer den von hMSSM stammenden Zellen wurden herausgefiltert.
   • Die abfiltrierte Lösung wurde im Brutschrank kultiviert. Tägliche morphologische Merkmale werden mit einem inversen Mikroskop beobachtet, und die Kulturlösung wird jeden zweiten Tag gewechselt. Wenn das Medium gewechselt wird, werden nicht an der Kulturplatte anhaftende Zellen entfernt und nur die anhaftenden Zellen werden kultiviert. Wenn die Kulturschalen fast konfluent werden, werden die Zellen mit Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) getrennt und anschließend zur weiteren Passage wiederholt. Die Zellen werden in Passage 3 auf ihr osteogenes Potenzial getestet.

2. Durchflusszytometrie. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) für die Expression von Osteoprogenitor-Zellmarkern wurde an Proben von Primärzellen (P0), Kulturen der Passage 1 (P1) und Kulturen der Passage 2 (P2), die in nicht-osteogenem Medium kultiviert wurden, durchgeführt.

   Es wird eine Durchflusszytometrie an den Zelloberflächenmarkern STRO-1, CD105 und CD146 zur Trennung mesenchymaler Vorläuferzellen (MPCs) von hMSM durchgeführt. Die von hMSSM stammenden Zellen in Passage 3 werden mit 1 x 104 Zellen/ml in ein Reagenzglas (Becton-Dickinson) gegeben und dreimal mit Waschpuffer (0,2 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Natriumazid, 0,5 mmol/l EDTA) gewaschen ). Die Antikörper von CD146 (BD Bioscience) und CD105 (BD Bioscience), an die Fluoresceinisothiocyanat und Phycoerythrin gebunden waren, werden 1 Stunde lang behandelt und dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und die Herkunft der Stammzellen wurde mit Durchflusszytometrie (BD Bioscience ). Für STRO-1 (menschlicher monoklonaler Anti-Maus-Antikörper, Immunglobulin-M-Unterklasse; R&D Systems) wurde der Antikörper 1 Stunde lang behandelt und dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und der sekundäre Antikörper, an den Fluoresceinisothiocyanat gebunden war, wurde 30 Minuten lang behandelt. dreimal mit Waschpuffer gewaschen und mit Durchflusszytometrie beobachtet.

3. Osteogene Differenzierung von hMSM

   Die von hMSM stammenden Zellen in Passage 3 wurden in osteogenen Medien für 1 bis 4 Wochen in Platten mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 10 5 Zellen pro Vertiefung inkubiert und in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe wurde in einem normalen Medium (vollständiges α-MEM) erneut ausplattiert, und die Versuchsgruppe wurde in osteogenem Differenzierungsmedium (α-MEM, das 0,1 μm Dexamethason, 10 μm Glycerolphosphat und 50 μm L-Ascorbinsäure-2-phosphat enthält, erneut ausplattiert ). Die Medien wurden alle 3 Tage gewechselt.

   3.1- Alkalische Phosphatase und Alizarinrot-Färbung. Kontroll- und Versuchskulturen wurden jeweils dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser 7, 14, 21 und 28 Tage nach dem Behandlungsdatum gewaschen, mit Citrat-Aceton-Formaldehyd-Fixierlösung (Sigma) fixiert und erneut dreimal mit sterilem gewaschen dreifach destilliertes Wasser. Anschließend wurden sie mit einer alkalischen Farbstoffmischung (Nitrit, Fast Red Violet-alkalisch, Naphthollauge; Sigma) im Dunkeln 15 Minuten bei Normaltemperatur gefärbt, dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen, mit Hämatoxylin (Sigma ), erneut dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen und mit einem umgekehrten Mikroskop beobachtet.

   Alizarinrot-Färbung. Kontroll- und Versuchsgruppenproben wurden jeweils dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser 7, 14, 21 und 28 Tage nach dem Behandlungsdatum gewaschen, mit 4 % Paraformaldehyd (Merck) für 15 Minuten fixiert, gefärbt, während Licht für 30 isoliert wurde Minuten mit 2%iger Alizarinrot-Lösung (Sigma) gewaschen, erneut dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen und die Färbung mit einem inversen Mikroskop beobachtet.

   3.2-Von-Kossa-Färbung. Kontroll- und Versuchskulturen wurden dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd (Merck) bei Normaltemperatur für 15 Minuten fixiert und erneut dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden 30 Minuten lang gefärbt, während Licht mit 1 %iger Silbernitratlösung (Merck) isoliert wurde, dreimal mit sterilem dreifach destilliertem Wasser gewaschen, 1 Stunde lang unter ultraviolettem Licht belassen, mit 0,1 % Eosin (Sigma) gegengefärbt und gefärbt wird mit einem inversen Mikroskop beobachtet.

   3.3- Quantitative PCR (qPCR). Um die Osteocalcin-Expression zu beobachten, wurden die von hMSM stammenden Zellen, differenziert in zwei Gruppen, mit (PBS) 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Behandlung in osteogenem Differenzierungsmedium gewaschen und mit einem Zellschaber gesammelt. Nachdem die Ribonukleinsäure (RNA) mit einem RNA-Extraktionskit abgetrennt wurde, wurde sie einer reversen Transkriptionsreaktion mit der abgetrennten RNA, dem Osteocalcin oder Knochensialoprotein oder den Primern und Sonden des Dentinmatrixproteins 1 und dem Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-Premix unterzogen (Angewandte Biosysteme). Die erhaltenen Daten werden mit 18 Shake normalisiert. Die amplifizierten Produkte wurden unter Verwendung der Deal-Delta-Computertomographie-Analyse analysiert.

4. Histochemische Färbung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in Gefrierschnitten der Sinusschleimhaut.

   Frisch präparierte Sinusschleimhaut wurde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in Stücke von etwa 5 × 5 mm geschnitten, in eine Gewebeverbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT-Verbindung; Miles Laboratories, USA) eingebettet und bei –80°C gelagert. Gefrorene Schnitte (7 mm), montiert auf Poly-D-Lysin-beschichteten Objektträgern, wurden mit eiskaltem Aceton für 1 min fixiert und an der Luft trocknen gelassen. Die Objektträger wurden mit PBS gewaschen und anschließend mit der Substratlösung für alkalische Phosphatase-Aktivität, enthaltend 4 mg Naphtholphosphat in 0,15 ml N,N0-Dimethylformamid und 12 mg Echtblausalz (Sigma, St. Louis, USA) in 15 inkubiert ml Tris-Chlorwasserstoff (pH 9,6). Nach dem Spülen mit destilliertem Wasser wurden die Objektträger mit Hämatoxylin-Eosin gegengefärbt, in wasserlösliches Harz eingebettet und fotografiert.

5. Immunhistochemische Bestimmung von STRO-1-positiven Zellen in gefrorenen Schleimhautschnitten.

Gefrorene Schnitte (7 mm) wurden mit kaltem Aceton für 1 min fixiert und in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden 15 Minuten lang in PBS mit 0,3 % Wasserstoffperoxid gegeben, um endogene Peroxidase zu quenchen, gewaschen und mit 2 % Rinderserumalbumin in PBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden mit einer 1:50-Verdünnung des STRO-1-Antikörpers (monoklonaler Maus-Antikörper, IgM-Subklasse; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) in Blockierungslösung über Nacht bei 41 °C inkubiert. Zum Nachweis von STRO-1- positive Zellen wurden die Objektträger jeweils mit einem biotinylierten Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin M (IgM) (1 : 100, An der Grub, Wien, Österreich) und einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) inkubiert 45 min bei Zimmertemperatur. Der Peroxidase enthaltende Komplex wurde durch Diaminobenzidin-Substrat (Dako, Glostrup, Dänemark) sichtbar gemacht und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Schnitte wurden in wasserlösliches Harz eingebettet und fotografiert.