Ihmisen poskionteloluun Shneiderian kalvon osteogeeninen potentiaali (HMSSM)

1. hMSM-peräisten solujen eristäminen ja viljely.

   Kudos pestään uudelleen fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi antibioottia ja antimytoottista ainetta, leikataan pieniksi paloiksi aseptisissa olosuhteissa, käsitellään 0,06 % kollagenaasi tyyppi II:lla (In vitrogen) ja dispasoidaan, ravistetaan inkubaattorissa (CO2-inkubaattori, Forma). Tieteellinen), joka sisälsi 5 % CO2:ta 37 °C:ssa 4 tunnin ajan ja sentrifugoitiin 1000 nopeudella (kierros minuutissa) 10 minuuttia (suurikapasiteettinen pöytäsentrifugi).

   • Sakka suspendoitiin alfa-minimi-väliaineeseen (α-MEM) (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä, ja suodatettiin 40 μm:n solusiivilä (BD Bioscience), jolla kaikki kudokset hMSSM-peräisiä soluja lukuun ottamatta suodatettiin pois.
   • Suodatettua liuosta viljeltiin inkubaattorissa. Päivittäisiä morfologisia ominaisuuksia tarkkaillaan käänteisellä mikroskoopilla, ja viljelyliuos vaihdetaan joka toinen päivä. Kun väliainetta vaihdetaan, solut, jotka eivät tartu viljelylevyyn, poistetaan ja vain kiinnittyviä soluja viljellään. Kun viljelymaljoista tulee lähes konfluentteja, solut erotetaan trypsiini-etyleenidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA) ja toistetaan sen jälkeen jatkuvaa kulkua varten. Solujen osteogeeninen potentiaali analysoidaan siirrostuksessa 3.

2. Virtaussytometria. Fluoresenssiaktivoidun solulajittelun (FACS) analyysi osteoprogenitorisolumarkkerien ilmentämiseksi suoritettiin näytteille primäärisoluista (P0), siirrostus 1 (P1) -viljelmistä ja passage 2 (P2) -viljelmistä, joita viljeltiin ei-nosteogeenisessa väliaineessa.

   Suoritetaan virtaussytometria solun pintamarkkereille STRO-1, CD105 ja CD146 mesenkymaalisten progenitorisolujen (MPC) erottamiseksi hMSM:stä. hMSSM-peräiset solut siirrostuksessa 3 laitetaan koeputkeen (Becton-Dickinson) 1 x 104 solua/ml ja pestään kolme kertaa pesupuskurilla (0,2 % naudan seerumialbumiinia, 0,1 % natriumatsidia, 0,5 mmol/l EDTA:ta). ). CD146:n (BD Bioscience) ja CD105:n (BD Bioscience) vasta-aineita, joihin fluoreseiini-isotiosyanaattia ja fykoerytriiniä kiinnitettiin, käsitellään 1 tunnin ajan ja pestään pesupuskurilla kolme kertaa, ja kantasolujen alkuperä tarkkaillaan virtaussytometrillä (BD bioscience). ). STRO-1:n (ihmisen antihiiri-monoklonaalinen vasta-aine, immunoglobuliini M -alaluokka; R&D Systems) vasta-ainetta käsiteltiin 1 tunnin ajan ja pestiin kolme kertaa pesupuskurilla, ja sekundaarista vasta-ainetta, johon fluoreseiini-isotiosyanaatti oli kiinnitetty, käsiteltiin 30 minuuttia, pestiin kolme kertaa pesupuskurilla ja tarkkailtiin virtaussytometrialla.

3. hMSM:n osteogeeninen erilaistuminen

   HMSM-peräisiä soluja siirrostuksessa 3 inkuboitiin osteogeenisessä väliaineessa 1 - 4 viikkoa 12-kuoppaisilla levyillä tiheydellä 105 solua per kuoppa ja jaettiin kahteen ryhmään. Kontrolliryhmä maljattiin uudelleen normaaliin alustaan ​​(täydellinen α-MEM) ja koeryhmä maljattiin uudelleen osteogeeniseen erilaistumisalustaan ​​(α-MEM, joka sisälsi 0,1 μm deksametasonia, 10 μm glyserolifosfaattia ja 50 μm L-askorbiinihappoa 2-fosfaattia ). Media vaihdettiin 3 päivän välein.

   3.1 - Alkalinen fosfataasi ja Alizarin Red -värjäys. Kontrolli- ja koeviljelmät pestiin kumpikin kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä 7, 14, 21 ja 28 päivää käsittelypäivän jälkeen, kiinnitettiin sitraatti-asetoni-formaldehydi-kiinnitysliuoksella (Sigma) ja pestiin uudelleen kolme kertaa steriilillä. kolminkertaisesti tislattua vettä. Sitten ne värjättiin emäksisellä väriseoksella (nitriitti, Fast Red Violet-alkaline, nafthol alkaline liuos; Sigma), pimeässä 15 minuuttia normaalilämpötilassa, pestiin kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä, vastavärjättiin hematoksyliinillä (Sigma) ), pestiin uudelleen kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä ja tarkkailtiin käänteisellä mikroskoopilla.

   Alizariinin punainen värjäys. Kontrolli- ja koeryhmän näytteet pestiin kukin kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä 7, 14, 21 ja 28 päivän kuluttua käsittelypäivästä, kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä (Merck) 15 minuutin ajan, värjättiin samalla kun valo eristettiin 30 minuutin ajan. minuuttia 2-prosenttisella alitsariinipunaliuoksella (Sigma), pestiin uudelleen kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä, ja värjäytymistä tarkkaillaan käänteisellä mikroskoopilla.

   3.2 - Von Kossa -värjäys. Kontrolli- ja koeviljelmät pestiin kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä, kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä (Merck) normaalissa lämpötilassa 15 minuutin ajan ja pestiin uudelleen kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä. Niitä värjättiin 30 minuuttia, samalla kun valo eristettiin 1-prosenttisella hopeanitraattiliuoksella (Merck), pestiin kolme kertaa steriilillä kolminkertaisesti tislatulla vedellä, jätettiin ultraviolettivalon alle 1 tunniksi, vastavärjättiin 0,1-prosenttisella eosiinilla (Sigma) ja värjättiin. tarkkaillaan käänteisellä mikroskoopilla.

   3.3 - Kvantitatiivinen PCR (qPCR). Osteokalsiinin ilmentymisen tarkkailemiseksi hMSM-peräiset solut, jotka erilaistettiin kahteen ryhmään, pestiin (PBS) 7, 14, 21 ja 28 päivän kuluttua käsittelystä osteogeenisessa erilaistumisväliaineessa ja kerättiin solukaapimella. Kun ribonukleiinihappo (RNA) oli erotettu RNA:n uuttopakkauksella, se käy läpi käänteistranskriptioreaktion erotetun RNA:n, osteokalsiinin tai luun sialoproteiinin tai dentiinimatriisiproteiini 1:n alukkeiden ja koettimien sekä käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktion esiseoksen kanssa. (Applied Biosystems). Saadut tiedot normalisoidaan käyttämällä 18 Shake -toimintoa. Monistetut tuotteet analysoitiin käyttämällä deal-delta Computer Tomography -analyysiä.

4. Alkalisen fosfataasin aktiivisuuden histokemiallinen värjäys sinus-limakalvon jäädytetyissä osissa.

   Juuri valmistettu poskiontelon limakalvo pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), leikattiin noin 5 x 5 mm:n paloiksi, upotettiin optimaalisen leikkauslämpötilan kudosyhdisteeseen (OCT-yhdiste; Miles Laboratories, USA) ja säilytettiin -80 C:ssa. Pakastetut leikkeet. (7 mm), jotka oli asennettu poly-D-lysiinillä päällystetyille objektilaseille, kiinnitettiin jääkylmällä asetonilla 1 minuutin ajan ja annettiin kuivua ilmassa. Objektilasit pestiin PBS:llä ja inkuboitiin sen jälkeen alkalisen fosfataasiaktiivisuuden substraattiliuoksen kanssa, joka sisälsi 4 mg naftolifosfaattia 0,15 ml:ssa N,N0-dimetyyliformamidia ja 12 mg nopeaa sinistä suolaa (Sigma, St Louis, USA) 15 °C:ssa. ml Tris-vetykloridia (pH 9,6). Tislatulla vedellä huuhtelun jälkeen objektilasit vastavärjättiin hematoksyliini-eosiinilla, upotettiin vesiliukoiseen hartsiin ja valokuvattiin.

5. STRO-1-positiivisten solujen immunohistokemiallinen määritys limakalvon jäädytetyissä osissa.

Jäädytetyt leikkeet (7 mm) kiinnitettiin kylmällä asetonilla 1 minuutin ajan ja pestiin PBS:ssä. Objektilasit laitettiin PBS:ään, joka sisälsi 0,3 % vetyperoksidia, 15 minuutiksi endogeenisen peroksidaasin sammuttamiseksi, pestiin ja blokattiin 2 % naudan seerumialbumiinilla PBS:ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin STRO-1-vasta-aineen (hiiren monoklonaalinen vasta-aine, IgM-alaluokka; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) 1:50-laimennoksella estoliuoksessa yön yli 41 °C:ssa. STRO-1-:n havaitsemiseen positiivisia soluja, objektilaseja inkuboitiin biotinyloidun vuohen anti-hiiri-immuuniglobuliinin M (IgM) (1:100, An der Grub, Wien, Itävalta) ja streptavidiini-peroksidaasikonjugaatin (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) kanssa kummankin kanssa. huoneenlämmössä 45 min. Peroksidaasia sisältävä kompleksi visualisoitiin diaminobentsidiinisubstraatilla (Dako, Glostrup, Tanska) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Leikkeet upotettiin vesiliukoiseen hartsiin ja valokuvattiin.