Det osteogene potentiale af menneskelig maxillær sinus Shneiderian membran (HMSSM)

1. Isolering og dyrkning af hMSM-afledte celler.

   Vævet vil blive vasket igen med Phosphate Buffered Saline (PBS), der indeholdt antibiotika og antimytotikum, skåret i små stykker under aseptiske forhold, behandlet med 0,06 % collagenase type II (in vitrogen) og dispase, rystet med en inkubator (CO2-inkubator, Forma) Scientific) indeholdende 5% CO2 ved 37°C i 4 timer og centrifugeret ved 1.000 (omdrejning pr. minut) i 10 minutter (bordcentrifuge med stor kapacitet).

   • Bundfaldet blev suspenderet i et alfa-minimum essentielt medium (α-MEM) (Sigma-Aldrich) indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin og filtreret med en 40-μm cellefilter (BD Bioscience), hvormed alt væv bortset fra de hMSSM-afledte celler blev filtreret fra.
   • Den frafiltrerede opløsning blev dyrket i en inkubator. Daglige morfologiske karakteristika vil blive observeret med et omvendt mikroskop, og kulturopløsningen vil blive skiftet hver anden dag. Når mediet vil blive skiftet, vil celler, der ikke klæber til dyrkningspladen, blive fjernet, og kun de klæbende celler vil blive dyrket. Når dyrkningsskålene bliver næsten sammenflydende, vil cellerne blive adskilt med trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og efterfølgende gentaget for fortsat passage. Cellerne vil blive analyseret ved passage 3 for deres osteogene potentiale.

2. Flowcytometri. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse for ekspressionen af ​​osteoprogenitorcellemarkører blev udført på prøver fra primære celler (P0), passage 1 (P1) kulturer og passage 2 (P2) kulturer dyrket i ikke-steogent medium.

   Flowcytometri på celleoverflademarkørerne STRO-1, CD105 og CD146 til adskillelse af mesenkymale progenitorceller (MPC'er) fra hMSM vil blive udført. De hMSSM-afledte celler ved passage 3 vil blive anbragt i et reagensglas (Becton-Dickinson) med 1 x 104 celler/ml og vasket tre gange med vaskebuffer (0,2 % bovint serumalbumin, 0,1 % natriumazid, 0,5 mmol/L EDTA ). Antistofferne af CD146 (BD Bioscience) og CD105 (BD Bioscience), hvortil fluorescein isothiocyanat og phycoerythrin var klæbet, vil blive behandlet i 1 time og vasket med vaskebuffer tre gange, og stamcellens oprindelse blev observeret med flowcytometri (BD bioscience) ). For STRO-1 (humant antimus monoklonalt antistof, immunoglobulin M underklasse; R&D Systems) blev antistof behandlet i 1 time og vasket tre gange med vaskebuffer, og det sekundære antistof, som fluorescein isothiocyanat var knyttet til, blev behandlet i 30 minutter, vasket tre gange med vaskebuffer og observeret med flowcytometri.

3. Osteogen differentiering af hMSM

   De hMSM-afledte celler ved passage 3 blev inkuberet i osteogene medier i 1 til 4 uger i 12-brøndsplader ved en tæthed på 105 celler pr. brønd og opdelt i to grupper. Kontrolgruppen blev genudpladet i et normalt medium (komplet α-MEM), og forsøgsgruppen blev genudpladet i osteogent differentieringsmedium (α-MEM inklusive 0,1 μm dexamethason, 10 μm glycerolphosphat og 50 μm L-ascorbinsyre 2-phosphat ). Medierne blev skiftet hver 3. dag.

   3.1- Alkalisk fosfatase og Alizarin rød farvning. Kontrolkulturer og forsøgskulturer blev hver vasket tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand 7, 14, 21 og 28 dage efter behandlingsdatoen, fikseret med citrat-acetone-formaldehyd-fikseringsopløsning (Sigma) og vasket igen tre gange med steril tredobbelt destilleret vand. De blev derefter farvet med en alkalisk farveblanding (nitrit, hurtig rød violet-alkalisk, alkalisk naphtholopløsning; Sigma), i mørke i 15 minutter ved normal temperatur, vasket tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand, modfarvet med hæmatoxylin (Sigma) ), vasket igen tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand og observeret med et omvendt mikroskop.

   Alizarin rød farvning. Kontrol- og forsøgsgruppeprøver blev hver vasket tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand 7, 14, 21 og 28 dage fra behandlingsdatoen, fikseret med 4% paraformaldehyd (Merck) i 15 minutter, farvet, mens lyset blev isoleret i 30 minutter. minutter med 2 % alizarinrød opløsning (Sigma), vaskes igen tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand, og farvningen vil blive observeret med et omvendt mikroskop.

   3.2- Von Kossa-farvning. Kontrolkulturer og forsøgskulturer blev vasket tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand, fikseret med 4% paraformaldehyd (Merck) ved en normal temperatur i 15 minutter og vasket igen tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand. De blev farvet i 30 minutter, mens lys blev isoleret med 1 % sølvnitrat (Merck) opløsning, vasket tre gange med sterilt tredobbelt destilleret vand, efterladt under ultraviolet lys i 1 time, modfarvet med 0,1 % eosin (Sigma) og farvningen vil blive observeret med et omvendt mikroskop.

   3.3- Kvantitativ PCR (qPCR). For at observere osteocalcinekspression blev de hMSM-afledte celler, differentieret i to grupper, vasket med (PBS) 7, 14, 21 og 28 dage efter behandling i osteogent differentieringsmedium og opsamlet med en celleskraber. Efter at ribonukleinsyren (RNA) var separeret med et RNA-ekstraktionssæt, gennemgik den en omvendt transkriptionsreaktion med det separerede RNA, osteocalcin eller knoglesialoprotein eller dentinmatrixprotein 1-primere og prober og revers-transkriptase-polymerase-kædereaktionspræmix (Anvendte biosystemer). De opnåede data vil blive normaliseret ved hjælp af 18 Shake. De amplificerede produkter blev analyseret under anvendelse af deal-delta computertomografi-analysen.

4. Histokemisk farvning af alkalisk fosfataseaktivitet i frosne sektioner af sinus slimhinde.

   Frisk fremstillet sinus slimhinde blev vasket i phosphatpufret saltvand (PBS), skåret i stykker på ca. 5x5 mm, indlejret i optimal skæretemperaturvævsforbindelse (OCT-forbindelse; Miles Laboratories, USA) og opbevaret ved -80 C. Frosne sektioner (7 mm) monteret på poly-D-lysin-coatede objektglas blev fikseret med iskold acetone i 1 min og fik lov til at lufttørre. Objektglassene blev vasket med PBS og efterfølgende inkuberet med substratopløsningen for alkalisk phosphataseaktivitet indeholdende 4 mg naphtholphosphat i 0,15 ml N, N0-dimethylformamid og 12 mg hurtigt blåt salt (Sigma, St. Louis, USA) i 15 ml tris-hydrogenchlorid (pH 9,6). Efter skylning med destilleret vand blev objektglassene modfarvet med hæmatoxylin-eosin, indlejret i vandopløselig harpiks og fotograferet.

5. Immunhistokemisk bestemmelse af STRO-1-positive celler i frosne sektioner af slimhinden.

Frosne sektioner (7 mm) blev fikseret med kold acetone i 1 min og vasket i PBS. Objektglassene blev anbragt i PBS indeholdende 0,3% hydrogenperoxid i 15 minutter for at standse endogen peroxidase, vasket og blokeret med 2% bovint serumalbumin i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Sektioner blev inkuberet med en 1:50 fortynding af STRO-1-antistoffet (monoklonalt museantistof, IgM-underklasse; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) i blokeringsopløsning natten over ved 41 grader C. Til påvisning af STRO-1- positive celler, objektglas blev inkuberet med et biotinyleret gede-anti-muse-immunglobulin M (IgM) (1 : 100, An der Grub, Wien, Østrig) og et streptavidin-peroxidase-konjugat (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) hver ved stuetemperatur i 45 min. Det peroxidaseholdige kompleks blev visualiseret med Diaminobenzidin-substrat (Dako, Glostrup, Danmark) og modfarvet med hæmatoxylin. Sektionerne blev indlejret i vandopløselig harpiks og fotograferet.