Az emberi maxilláris sinus Shneideri membrán osteogén potenciálja (HMSSM)

1. hMSM-eredetű sejtek izolálása és tenyésztése.

   A szövetet újra mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), amely antibiotikumot és antimitotikumot is tartalmaz, aszeptikus körülmények között apró darabokra vágjuk, 0,06%-os II típusú kollagenázzal (In vitrogen) kezeljük, majd szétszűrjük, inkubátorral (CO2 inkubátor, Forma) rázzuk. Tudományos) 5% CO2-t tartalmazó 37 °C-on 4 órán át, és 1000-es fordulatszámmal (percenkénti fordulatszám) centrifugálva 10 percig (nagy kapacitású asztali centrifuga).

   • A csapadékot 10% magzati szarvasmarha szérumot és 1% penicillin-sztreptomicint tartalmazó alfa minimum esszenciális tápközegben (α-MEM) (Sigma-Aldrich) szuszpendáltuk, és 40 μm-es sejtszűrőn (BD Bioscience) szűrtük, amely minden szövetet tartalmaz. kivéve a hMSSM-eredetű sejteket kiszűrtük.
   • A kiszűrt oldatot inkubátorban tenyésztjük. A napi morfológiai jellemzőket fordított mikroszkóppal figyeljük meg, és a tenyészoldatot minden második napon cseréljük. Amikor a táptalajt cseréljük, a tenyésztőlemezhez nem tapadt sejteket eltávolítjuk, és csak a tapadó sejteket tenyésztjük. Amikor a tenyészedények majdnem összefolynak, a sejteket tripszin-etilén-diamin-tetraecetsavval (EDTA) elválasztjuk, majd megismételjük a folyamatos passzáláshoz. A sejtek oszteogén potenciálját a 3. passzázsnál megvizsgáljuk.

2. Áramlási citometria. Az oszteoprogenitor sejtmarkerek expressziójának fluoreszcenciával aktivált sejtválogató (FACS) analízisét primer sejtekből (P0), passzázs 1-es (P1) és passzázs 2-es (P2) tenyészetekből származó mintákon végezték, amelyeket nem noszteogén tápközegben tenyésztettek.

   A STRO-1, CD105 és CD146 sejtfelszíni markereken áramlási citometriát végeznek a mezenchimális progenitor sejtek (MPC) hMSM-től való elválasztására. A hMSSM-eredetű sejteket a 3. passzázsnál kémcsőbe (Becton-Dickinson) helyezzük 1 x 104 sejt/ml mennyiségben, és háromszor mossuk mosópufferrel (0,2% marhaszérum albumin, 0,1% nátrium-azid, 0,5 mmol/l EDTA ). A CD146 (BD Bioscience) és CD105 (BD Bioscience) antitesteket, amelyekhez fluoreszcein-izotiocianátot és fikoeritrint ragasztottak, 1 órán keresztül kezeljük, majd háromszor mossuk mosópufferrel, és áramlási citometriával (BD bioscience) figyeljük meg az őssejt eredetét. ). A STRO-1 (humán anti-egér monoklonális antitest, immunglobulin M alosztály; R&D Systems) ellenanyagát 1 órán át kezeltük, és háromszor mostuk mosópufferrel, és a másodlagos antitestet, amelyhez fluoreszcein-izotiocianátot kapcsoltak, 30 percig. háromszor mossuk mosópufferrel, és áramlási citometriával figyeljük meg.

3. A hMSM osteogén differenciálódása

   A hMSM-eredetű sejteket a 3. passzázsnál oszteogén tápközegben 1-4 hétig inkubáltuk 12 lyukú lemezeken 105 sejt/lyuk sűrűséggel, és két csoportra osztották. A kontrollcsoportot normál tápközegbe (teljes α-MEM), a kísérleti csoportot pedig oszteogén differenciáló táptalajba (α-MEM, amely 0,1 μm dexametazont, 10 μm glicerin-foszfátot és 50 μm L-aszkorbinsav 2-foszfátot tartalmazott ). A médiát 3 naponta cserélték.

   3.1 - Alkáli foszfatáz és alizarin vörös festés. A kontroll és a kísérleti tenyészeteket a kezelés időpontja után 7, 14, 21 és 28 nappal steril, háromszor desztillált vízzel háromszor mostuk, citrát-aceton-formaldehid fixáló oldattal (Sigma) rögzítettük, majd ismét háromszor mostuk steril vízzel. háromszoros desztillált víz. Ezután lúgos festékkeverékkel (nitrit, Fast Red Violet-alkaline, naftol lúgos oldat; Sigma) megfestettük őket sötétben 15 percig normál hőmérsékleten, háromszor mostuk steril, háromszor desztillált vízzel, majd hematoxilinnel (Sigma) ellenfestették. ), ismét háromszor mossuk steril, háromszor desztillált vízzel, és fordított mikroszkóppal figyeljük meg.

   Alizarin vörös festés. A kontroll és a kísérleti csoport mintáit a kezelés időpontjától számított 7., 14., 21. és 28. napon háromszor steril, háromszor desztillált vízzel mostuk, 4%-os paraformaldehiddel (Merck) fixáltuk 15 percig, majd festettük, miközben fényt izoláltunk 30 percig. perc 2%-os alizarin vörös oldattal (Sigma), steril háromszor desztillált vízzel ismét háromszor mossuk, és a festődést fordított mikroszkóppal figyeljük meg.

   3.2- Von Kossa festés. A kontroll és a kísérleti tenyészeteket háromszor mostuk steril, háromszor desztillált vízzel, 4%-os paraformaldehiddel (Merck) rögzítettük normál hőmérsékleten 15 percig, majd ismét háromszor mostuk steril, háromszor desztillált vízzel. 30 percig festettük őket, miközben a fényt 1%-os ezüst-nitrát (Merck) oldattal izoláltuk, steril háromszor desztillált vízzel háromszor mostuk, 1 órán át ultraibolya fény alatt hagytuk, 0,1%-os eozinnal (Sigma) ellenfestettük, majd a festést. fordított mikroszkóppal figyeljük meg.

   3.3. Kvantitatív PCR (qPCR). Az oszteokalcin expressziójának megfigyelésére a hMSM-eredetű sejteket, két csoportra differenciálva, mostuk (PBS) 7, 14, 21 és 28 nappal az oszteogén differenciáló tápközegben végzett kezelés után, és sejtkaparóval összegyűjtöttük. Miután a ribonukleinsavat (RNS) RNS extrakciós kittel szétválasztották, reverz transzkripciós reakción ment keresztül az elválasztott RNS-sel, oszteokalcinnal vagy csontszialoproteinnel, vagy dentin mátrix protein 1 primerekkel és próbákkal, valamint reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció előkeverékkel. (Alkalmazott biorendszerek). A kapott adatokat a 18 Shake segítségével normalizáljuk. Az amplifikált termékeket a deal-delta Computer Tomography analízissel elemeztük.

4. Az alkalikus foszfatáz aktivitás hisztokémiai festése a sinus nyálkahártya fagyasztott szakaszaiban.

   A frissen elkészített arcüreg nyálkahártyáját foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, körülbelül 5x5 mm-es darabokra vágtuk, optimális vágási hőmérsékletű szövetkeverékbe (OCT vegyület; Miles Laboratories, USA) ágyaztuk, és -80 C-on tároltuk. Fagyasztott metszetek (7 mm) poli-D-lizinnel bevont tárgylemezekre rögzítettük jéghideg acetonnal 1 percig, és hagytuk levegőn megszáradni. A tárgylemezeket PBS-sel mostuk, majd 4 mg naftol-foszfátot 0,15 ml N,N0-dimetil-formamidban és 12 mg gyorskék sóban (Sigma, St Louis, USA) tartalmazó alkálikus foszfatáz aktivitást vizsgáló szubsztrát oldattal inkubáltuk 15 °C-on. ml trisz-hidrogén-kloridot (pH 9,6). Desztillált vízzel történő öblítés után a tárgylemezeket hematoxilin-eozinnal ellenfestettük, vízoldható gyantába ágyaztuk, és lefényképeztük.

5. STRO-1-pozitív sejtek immunhisztokémiai meghatározása fagyasztott nyálkahártya metszetekben.

A fagyasztott metszeteket (7 mm) hideg acetonnal fixáltuk 1 percig, és PBS-ben mostuk. A tárgylemezeket 0,3% hidrogén-peroxidot tartalmazó PBS-be helyeztük 15 percre az endogén peroxidáz leállítására, mostuk és blokkoltuk PBS-ben készült 2% borjúszérum albuminnal 1 órán át szobahőmérsékleten. A metszeteket a STRO-1 antitest (egér monoklonális antitest, IgM alosztály; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) 1:50 arányú hígításával inkubáltuk blokkolóoldatban egy éjszakán át 41 °C-on. Az STRO-1- kimutatására pozitív sejteket, a tárgylemezeket biotinilezett kecske anti-egér immunglobulin M-vel (IgM) (1:100, An der Grub, Bécs, Ausztria) és sztreptavidin-peroxidáz konjugátummal (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) inkubáltuk. szobahőmérsékleten 45 percig. A peroxidáz tartalmú komplexet diaminobenzidin szubsztráttal (Dako, Glostrup, Dánia) tettük láthatóvá és hematoxilinnel ellenfestettük. A metszeteket vízoldható gyantába ágyaztuk és lefényképeztük.