Den osteogena potentialen hos det mänskliga maxillära sinus Shneiderian membranet (HMSSM)

1. Isolering och odling av hMSM-härledda celler.

   Vävnaden kommer att tvättas igen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som inkluderade antibiotika och antimytotikum, skärs i små bitar under aseptiska förhållanden, behandlas med 0,06 % kollagenas typ II (in vitrogen) och dispase, skakas med en inkubator (CO2-inkubator, Forma) Scientific) innehållande 5 % CO2 vid 37°C i 4 timmar och centrifugerad vid 1 000 (varv per minut) i 10 minuter (bordscentrifug med stor kapacitet).

   • Fällningen suspenderades i ett alfaminimum essentiellt medium (α-MEM) (Sigma-Aldrich) innehållande 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin och filtrerades med en 40 μm cellsil (BD Bioscience), med vilken alla vävnader förutom de hMSSM-härledda cellerna filtrerades bort.
   • Lösningen som filtrerades bort odlades i en inkubator. Dagliga morfologiska egenskaper kommer att observeras med ett inverterat mikroskop, och odlingslösningen kommer att bytas varannan dag. När mediet kommer att bytas, kommer celler som inte vidhäftar till odlingsplattan att tas bort och endast de vidhäftande cellerna kommer att odlas. När odlingsskålarna blir nästan sammanflytande, kommer cellerna att separeras med trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och därefter upprepas för fortsatt passage. Cellerna kommer att analyseras vid passage 3 för deras osteogena potential.

2. Flödescytometri. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys för uttryck av osteoprogenitorcellmarkörer utfördes på prover från primära celler (P0), passage 1 (P1) kulturer och passage 2 (P2) kulturer odlade i icke-steogent medium.

   Flödescytometri på cellytmarkörerna STRO-1, CD105 och CD146 för separation av mesenkymala progenitorceller (MPC) från hMSM kommer att utföras. De hMSSM-härledda cellerna vid passage 3 kommer att placeras i ett provrör (Becton-Dickinson) med 1 x 104 celler/ml och tvättas tre gånger med tvättbuffert (0,2 % bovint serumalbumin, 0,1 % natriumazid, 0,5 mmol/L EDTA ). Antikropparna från CD146 (BD Bioscience) och CD105 (BD Bioscience) till vilka fluoresceinisotiocyanat och fykoerytrin fästes kommer att behandlas i 1 timme och tvättas med tvättbuffert tre gånger, och stamcellens ursprung observerades med flödescytometri (BD bioscience) ). För STRO-1 (human antimus monoklonal antikropp, immunglobulin M underklass; FoU-system) behandlades antikroppen i 1 timme och tvättades tre gånger med tvättbuffert, och den sekundära antikroppen, till vilken fluoresceinisotiocyanat var fäst, behandlades i 30 minuter, tvättades tre gånger med tvättbuffert och observerades med flödescytometri.

3. Osteogen differentiering av hMSM

   De hMSM-härledda cellerna vid passage 3 inkuberades i osteogent medium under 1 till 4 veckor i plattor med 12 brunnar vid en densitet av 105 celler per brunn och delades upp i två grupper. Kontrollgruppen ströks om i ett normalt medium (komplett α-MEM), och experimentgruppen spreds om i osteogent differentieringsmedium (α-MEM inklusive 0,1 μm dexametason, 10 μm glycerolfosfat och 50 μm L-askorbinsyra 2-fosfat ). Media byttes var tredje dag.

   3.1- Alkaliskt fosfatas och Alizarin röd färgning. Kontrollkulturer och experimentkulturer tvättades var och en tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten 7, 14, 21 och 28 dagar efter behandlingsdatumet, fixerades med fixeringslösning citrat-aceton-formaldehyd (Sigma) och tvättades igen tre gånger med steril trippeldestillerat vatten. De färgades sedan med en alkalisk färgblandning (nitrit, Fast Red Violet-alkaline, naftol alkalisk lösning; Sigma), i mörker i 15 minuter vid normal temperatur, tvättades tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten, motfärgade med hematoxylin (Sigma) ) tvättades igen tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten och observerades med ett inverterat mikroskop.

   Alizarin röd färgning. Kontroll- och experimentgruppsprover tvättades vardera tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten 7, 14, 21 och 28 dagar från behandlingsdatumet, fixerades med 4 % paraformaldehyd (Merck) i 15 minuter, färgades medan ljuset isolerades i 30 minuter. minuter med 2 % alizarinröd lösning (Sigma), tvättas igen tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten, och färgningen kommer att observeras med ett inverterat mikroskop.

   3.2- Von Kossa-färgning. Kontrollkulturer och experimentkulturer tvättades tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten, fixerades med 4% paraformaldehyd (Merck) vid normal temperatur i 15 minuter och tvättades igen tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten. De färgades under 30 minuter medan ljuset isolerades med 1 % silvernitrat (Merck) lösning, tvättades tre gånger med sterilt trippeldestillerat vatten, lämnades under ultraviolett ljus i 1 timme, motfärgades med 0,1 % eosin (Sigma) och färgningen kommer att observeras med ett inverterat mikroskop.

   3.3- Kvantitativ PCR (qPCR). För att observera osteokalcinuttryck tvättades de hMSM-härledda cellerna, differentierade i två grupper, med (PBS) 7, 14, 21 och 28 dagar efter behandling i osteogent differentieringsmedium och samlades upp med en cellskrapa. Efter att ribonukleinsyran (RNA) separerades med ett RNA-extraktionskit, genomgick den en omvänd transkriptionsreaktion med det separerade RNA, osteokalcin eller bensialoprotein, eller dentinmatrisprotein 1-primrar och prober, och omvänt transkriptaspolymeraskedjereaktionspremix (Applied Biosystems). Erhållna data kommer att normaliseras med 18 Shake. De amplifierade produkterna analyserades med användning av deal-delta Computer Tomography-analysen.

4. Histokemisk färgning av alkaliskt fosfatasaktivitet i frusna sektioner av sinus slemhinna.

   Nyberedd sinus slemhinna tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), skars i bitar om cirka 5x5 mm, inbäddades i vävnadsblandning med optimal skärtemperatur (OCT-förening; Miles Laboratories, USA) och lagrades vid -80 C. Frysta sektioner (7 mm) monterade på poly-D-lysinbelagda objektglas fixerades med iskall aceton under 1 min och fick lufttorka. Objektglasen tvättades med PBS och inkuberades därefter med substratlösningen för alkalisk fosfatasaktivitet innehållande 4 mg naftolfosfat i 0,15 ml N,NO-dimetylformamid och 12 mg snabbt blått salt (Sigma, St Louis, USA) i 15 ml Tris-väteklorid (pH 9,6). Efter sköljning med destillerat vatten motfärgades objektglasen med hematoxylin-eosin, bäddades in i vattenlösligt harts och fotograferades.

5. Immunhistokemisk bestämning av STRO-1-positiva celler i frusna sektioner av slemhinnan.

Frysta sektioner (7 mm) fixerades med kall aceton under 1 min och tvättades i PBS. Objektglasen placerades i PBS innehållande 0,3 % väteperoxid under 15 minuter för att släcka endogent peroxidas, tvättades och blockerades med 2 % bovint serumalbumin i PBS under 1 timme vid rumstemperatur. Sektioner inkuberades med en 1:50 utspädning av STRO-1-antikroppen (mus monoklonal antikropp, IgM-underklass; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA) i blockerande lösning över natten vid 41 grader C. För detektion av STRO-1- positiva celler inkuberades objektglasen med ett biotinylerat get-antimus-immunglobulin M (IgM) (1 : 100, An der Grub, Wien, Österrike) och ett streptavidin-peroxidaskonjugat (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) vardera vid rumstemperatur i 45 min. Det peroxidasinnehållande komplexet visualiserades med diaminobensidinsubstrat (Dako, Glostrup, Danmark) och motfärgades med hematoxylin. Sektionerna bäddades in i vattenlösligt harts och fotograferades.