人上颌窦 Shneiderian 膜的成骨潜能 (HMSSM)

1. hMSM 衍生细胞的分离和培养。

   组织将再次用含有抗生素和抗真菌药的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤，在无菌条件下切成小块，用 0.06% II 型胶原酶（In vitrogen）和分散酶处理，用培养箱（CO2 培养箱，Forma Scientific) 含 5% CO2 37°C 4 小时，1000（转/分钟）离心 10 分钟（大容量台式离心机）。

   • 将沉淀物悬浮在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 α 最低必需培养基 (α-MEM) (Sigma-Aldrich) 中，并用 40 μm 细胞滤网（BD Bioscience）过滤，所有组织均使用除了 hMSSM 衍生的细胞被过滤掉。
   • 滤出的溶液在培养箱中培养。 每日用倒置显微镜观察形态学特征，隔日更换培养液。 更换培养基时，将去除未粘附在培养板上的细胞，只培养粘附的细胞。 当培养皿接近汇合时，细胞将用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (EDTA) 分离，随后重复进行继续传代。 将在第 3 代测定细胞的成骨潜力。

2. 流式细胞仪。 对在非成骨培养基中培养的原代细胞 (P0)、第 1 代 (P1) 培养物和第 2 代 (P2) 培养物的样本进行骨祖细胞标记物表达的荧光激活细胞分选 (FACS) 分析。

   将对用于从 hMSM 分离间充质祖细胞 (MPC) 的细胞表面标记 STRO-1、CD105 和 CD146 进行流式细胞术。 将第 3 代的 hMSSM 衍生细胞以 1 x104 个细胞/mL 放入试管（Becton-Dickinson）中，并用洗涤缓冲液（0.2% 牛血清白蛋白、0.1% 叠氮化钠、0.5 mmol/L EDTA）洗涤 3 次). 将粘附有异硫氰酸荧光素和藻红蛋白的CD146(BD Bioscience)和CD105(BD Bioscience)抗体处理1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，流式细胞仪观察干细胞来源(BD bioscience) ). 对于STRO-1（人抗小鼠单克隆抗体，免疫球蛋白M亚类；R&D Systems），抗体处理1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，二抗上附着异硫氰酸荧光素，处理30分钟，用洗涤缓冲液洗涤3次，流式细胞仪观察。

3. hMSM 的成骨分化

   将第 3 代的 hMSM 衍生细胞在 12 孔板中以每孔 105 个细胞的密度在成骨培养基中孵育 1 至 4 周，并分成两组。 对照组再接种普通培养基（完全α-MEM），实验组再接种成骨分化培养基（含0.1 μm地塞米松、10 μm磷酸甘油、50 μm L-抗坏血酸2-磷酸的α-MEM） ). 媒体每 3 天更换一次。

   3.1- 碱性磷酸酶和茜素红染色。 处理日期后7、14、21和28天，对照和实验培养物分别用无菌三蒸水洗涤3次，用柠檬酸盐-丙酮-甲醛固定液（Sigma）固定，并再次用无菌洗涤3次三重蒸馏水。 然后用碱性染料混合液（亚硝酸盐、固红紫-碱性、萘酚碱性溶液；Sigma）染色，常温避光15分钟，无菌三蒸水洗涤3次，苏木精（Sigma）复染),再用灭菌三蒸水冲洗3次,倒置显微镜观察。

   茜素红染色。 对照组和实验组样品分别于治疗后第7、14、21、28天用无菌三蒸水洗涤3次，4%多聚甲醛（默克）固定15分钟，避光染色30 2%茜素红溶液（Sigma公司）分钟，再用无菌三蒸水洗涤3次，倒置显微镜观察染色情况。

   3.2- 冯科萨染色。 对照和实验培养物用无菌三次蒸馏水洗涤三次，在常温下用4％多聚甲醛（Merck）固定15分钟并再次用无菌三次蒸馏水洗涤三次。 染色 30 分钟，同时用 1% 硝酸银（Merck）溶液隔离光，用无菌三蒸水洗涤 3 次，在紫外光下放置 1 小时，用 0.1% 曙红（Sigma）复染，染色将用倒置显微镜观察。

   3.3- 定量 PCR (qPCR)。 为了观察骨钙蛋白的表达，hMSM 衍生细胞分化成两组，在成骨分化培养基处理后第 7、14、21 和 28 天用 (PBS) 洗涤，并用细胞刮刀收集。 核糖核酸（RNA）用RNA提取试剂盒分离后，与分离的RNA、骨钙素或骨唾液蛋白、或牙本质基质蛋白1引物和探针、逆转录酶聚合酶链反应预混液进行逆转录反应（应用生物系统）。 获得的数据将使用 18 Shake 进行归一化。 使用 deal-delta Computer Tomography 分析扩增产物。

4. 鼻窦粘膜冰冻切片中碱性磷酸酶活性的组织化学染色。

   新鲜制备的鼻窦粘膜在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗，切成约 5 x 5 毫米的碎片，包埋在最佳切割温度的组织复合物（OCT 复合物；Miles Laboratories，美国）中，并储存在 - 80°C。冷冻切片(7 mm) 安装在聚-D-赖氨酸涂层的载玻片上，用冰冷的丙酮固定 1 分钟，然后风干。 载玻片用 PBS 洗涤，随后与碱性磷酸酶活性底物溶液一起孵育，该底物溶液在 15 mL 中含有 4 mg 萘酚磷酸盐和 0.15 ml N, N0-二甲基甲酰胺和 12 mg 坚牢蓝盐（Sigma, St Louis, USA） ml Tris-氯化氢 (pH 9.6)。 用蒸馏水冲洗后，载玻片用苏木精-伊红复染，包埋到水溶性树脂中，并拍照。

5. 粘膜冰冻切片中 STRO-1 阳性细胞的免疫组织化学测定。

冰冻切片 (7 mm) 用冷丙酮固定 1 分钟并在 PBS 中洗涤。 将载玻片置于含有0.3%过氧化氢的PBS中15分钟以淬灭内源性过氧化物酶，洗涤，并在室温下用PBS中的2%牛血清白蛋白封闭1小时。 将切片与 1:50 稀释的 STRO-1 抗体（小鼠单克隆抗体，IgM 亚类；发育研究杂交瘤库，美国爱荷华大学）在 41 摄​​氏度的封闭溶液中孵育过夜。用于检测 STRO-1-阳性细胞，将载玻片分别与生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白 M (IgM)（1:100，An der Grub，Vienna，Austria）和链霉亲和素-过氧化物酶结合物（BioFX Laboratories，Inc.，MD，USA）一起孵育在室温下放置 45 分钟。 含过氧化物酶的复合物通过二氨基联苯胺底物（Dako，Glostrup，丹麦）显现，并用苏木精复染。 将切片包埋在水溶性树脂中并拍照。